刘 红,马 辉,曹 宏,李阳鸣,包建忠,陈秀兰,孙 叶,4,*
(1.扬州辐照中心,江苏扬州 225007; 2.江苏里下河地区农业科学研究所,江苏扬州 225007; 3.扬州循天岭生物科技有限公司,江苏扬州 225007; 4.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009)
蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草或北虫草,作为名贵的药食两用真菌(中药国药准字Z20030034/35),已被国家科技部批准为冬虫夏草的替代品和新资源食品[1]。与冬虫夏草相似,蛹虫草含有核苷、虫草多糖、虫草酸、SOD等功能成分,以及丰富的蛋白质和矿物质等[2-3],此外,还含有冬虫夏草所没有的虫草素和喷司他丁抗癌活性成分[4],使其具有抗癌、抗病毒、抗炎、抗疲劳、免疫调节、降糖降脂和护肝等功效[5-10]。
营养素生态重组是指在不使用酶制剂或基因修饰技术以及不进行营养素强化的条件下,用益生菌、酵母、真菌乃至反刍动物体内所特有的代谢机制来转化天然底物中的相应成分,使不同营养素重新组合产生新物质的一种动态体系[11]。用人工培养基培养蛹虫草,即将蛹虫草菌作为生态转化的工具,得到被蛹虫草真菌生态转化的培养基和菌丝体共存的结构,即为谷物蛹虫草菌丝共生体。培养基经蛹虫草菌发酵后,既具有谷物食品的营养成分,又存在大量对人体有益的功能成分,主要源于微生物产生的代谢产物以及微生物酶对谷物分解后产生的分解产物[12],还含有虫草素、虫草多糖、腺苷等虫草特有的活性物质,以及生物碱、帖类化合物、甾醇、苷类、酚类、酶、维生素、SOD等有效成分[13],极具保健食品开发潜力。
杂粮是低血糖生成指数(Glycemic Index,GI)主食,低GI食物含缓慢吸收糖及可溶性黏性纤维,可增加肠道内容物黏性,降低淀粉和消化酶的相互作用,抑制餐后血糖升高,有利于餐后血糖平稳[14];同时能够调节肠道菌群结构,改善肠道微生态[15]。
蛹虫草人工培养基大多以小麦或大米为主要原料,而本研究选用多种杂粮以不同比例配合,收获子实体后得到杂粮蛹虫草菌丝共生体,该共生体兼具蛹虫草保健功能和低GI食物特点。本研究通过比较不同杂粮培养基培养蛹虫草的生产性能,分析收获子实体后的培养基滋味物质组成,探究生产性能高、滋味好的培养基配方,旨在为高效生产蛹虫草及培养基开发利用提供理论依据。
蛹虫草[Cordycepsmilitaris]菌株(Cm-29) 由扬州循天岭生物科技有限公司保藏并提供;液体培养基配方 葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、MgSO41 g、KH2PO40.5 g、VB10.08 g、水1 L,以上试剂购自国药集团化学试剂有限公司;栽培培养基配方见表1 营养液配方为白糖15 g、脱脂奶粉10 g、水1 L,除水外所有原料购自超市,以玻璃瓶为栽培容器,每瓶培养基含有25 g原料和50 mL营养液,pH自然;虫草素、腺苷标准品 上海源叶生物科技有限公司;氨基酸标准品、有机酸标准品、核苷酸标准品 美国Sigma公司;甲醇、乙腈 色谱纯,国药集团;无水醋酸钠、冰醋酸、盐酸、三乙胺乙腈、异硫氰酸苯酯乙腈、淀粉酶、醋酸、磷酸盐缓冲液 分析纯,国药集团。
表1 培养基基质配方Table 1 Culture medium formula
Agilent 1260 Infinity LC高效液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;GHP-300智能培养箱 上海三发科学仪器有限公司;TGL-16M离心机 上海卢相仪离心机仪器有限公司;CU-600电热恒温水浴槽 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2.1 蛹虫草培养 参考本研究室改良方法[16],将菌株Cm-29从4 ℃冷藏箱中取出,于室温放置一周活化,用接种铲切取0.5 cm×0.5 cm大小菌种块接种于液体培养基,对其20 ℃震荡培养7 d后接种于栽培培养基,8 mL/瓶,每个处理10个重复。
观察记录菌丝在栽培培养基上的生长情况,即发菌周期(从接种到菌丝覆盖整个栽培培养基表面的时间)、转色周期(培养基表面菌丝从白色变成黄色的时间)、子实体成熟周期(转色后进行扫菌,培养至子实体成熟的时间),待子实体长7~10 cm时即可采收,记录每瓶子实体的生产性能成绩,包括子实体鲜重、干重、干物质百分比及生物转化率。子实体通风干燥后,于65 ℃烘箱中烘干至恒重,粉碎,过100目筛备用。培养基干燥同子实体,干燥后先经粉碎机粗略粉碎至米粒大小,取部分样品用于制作蛹虫草粗杂粮粥;剩余部分再经粉碎机粉碎,并过100目筛,用于滋味物质测定。
生物转化率(%)=子实体干重/投入的干物料重量×100
1.2.2 蛹虫草杂粮粥制备 分别取10组烘干粉碎的培养基15 g,按1∶8的比例加入水,煮沸10 min,静置5 min。
1.2.3 蛹虫草杂粮粥制备与感官评价 参照张家奇[17]的方法略作改动。对10组蛹虫草杂粮粥的色泽、风味和滋味的喜好性进行评分(标准见表2)进行评分。有10位感官评价员参与试验,评定后,分别逐项记入评分表,结果用评语和评分表示。
表2 感官评定评分标准Table 2 Sensory evaluation criterion
根据生产性能成绩及蛹虫草杂粮粥的感观评价结果,筛选出生产性能、感官评分优异的3组处理,对子实体虫草素、腺苷含量进行测定,并对培养基进行滋味成分分析。
1.2.4 蛹虫草子实体虫草素、腺苷含量的测定
1.2.4.1 样品待测液的制备 称取0.1 g样品(精确到0.0001 g)于25 mL容量瓶中,加入20 mL提取液,摇匀,沸水浴60 min,取出冷却后用提取液定容到25 mL,混匀,经0.22 μm滤器过滤,得到待测样品液。
1.2.4.2 高效液相色谱条件 色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相水与甲醇的体积比为85∶15,流速1.0 mL/min,柱温40 ℃,紫外检测器波长254 nm,分析时长2 0 min,进样量20 μL。
1.2.5 培养基水解氨基酸含量的测定
1.2.5.1 样品溶液制备 取0.5 g干燥培养基粉末样品于20 mL的水解管中,加入16 mL 6 mol/L的盐酸溶液,真空脱气30 min,充氮封管,在110 ℃下水解22~24 h,取出冷却至室温后开管,用去离子水无损转移到50 mL容量瓶中,并定容。取200 μL,参照苏瑞景[18]所述方法进行衍生化。取衍生后溶液200 μL,加入800 μL纯净水稀释。经0.22 μm滤器过滤,得到待测样品液。氨基酸混合标准溶液同法衍生、测定。
1.2.5.2 高效液相色谱条件 流动相A:0.1 mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2 g,加水900 mL溶解,用冰醋酸调pH至6.5,然后加水至1000 mL)与乙腈体积比为93∶7;流动相B:乙腈与水体积比为8∶2。
仪器为Agilent 1260,色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×250 mm×5 μm),流速1.0 mL/min;柱温40 ℃,检测波长254 nm,进样量20 μL。洗脱梯度如表3。
表3 氨基酸梯度洗脱程序Table 3 Gradient elution program of amino acids
1.2.5.3 氨基酸组成及含量分析 根据标准曲线(数据未列出)计算各氨基酸的含量,分别统计总氨基酸(total amino acids,TAA)、必需氨基酸(essential amino acids,EAA)和呈味氨基酸(delicious amino acids,DAA)的含量。DAA主要分为鲜味、甜味和苦味氨基酸三大类[19]。
1.2.6 培养基呈味核苷酸含量的测定
1.2.6.1 样品溶液制备 称取混合均匀的试样约5 g于100 mL锥形瓶中,加入约0.2 g淀粉酶,加入20 mL热水(30~40 ℃)充分溶解试样,于(37±2) ℃培养箱内酶解30 min。取出冷却至室温。用醋酸溶液调试样品溶液至pH4.1,移入50 mL容量瓶中,定容,经0.22 μm滤器过滤,得到待测样品液。
1.2.6.2 高效液相色谱条件 HPLC仪、色谱柱同1.2.4.2。流动相磷酸盐缓冲溶液与甲醇体积比为95∶5,流速1 mL/min,柱温箱25 ℃,检测波长254 nm,进样量20 μL。
1.2.7 培养基有机酸含量的测定
1.2.7.1 样品溶液制备 取0.1 g样品,加入20 mL 10 mmol/L磷酸氢二钾,超声提取30 min,于60 ℃水浴锅加热1 h,冷却后离心,经0.22 μm滤器过滤,得到待测样品液。
1.2.7.2 高效液相色谱条件 HPLC仪、色谱柱1.2.4.2。流动相为10 mmol/L磷酸氢二钾(磷酸调节pH2.55),流速为0.5 mL/min,柱温30 ℃,检测波长210 nm,进样量10 μL。
1.2.8 味道强度值计算 味道强度值(Taste activity value,TAV)指样品中各呈味物质的测定值与该物质味道阈值之比。阈值表示呈味物质在水溶液中有味觉刺激的最小质量浓度。通常认为,当TAV≥1时,表示该呈味物质具有滋味活性,对样品呈味有显著影响,并且数值越大贡献越大;TAV<1时,该呈味物质对整体滋味贡献不明显[20-21],由此可以确定主要的呈味物质。
试验数据采用SPSS 17.0统计软件处理,One-Way ANOVA 程序进行方差分析,用Duncan氏法进行多重比较,p<0.05表示差异显著,p<0.01表示差异极显著。
采用上述培养基培养蛹虫草,所有配方均能形成子实体。由表4可知,培养基1的菌丝布满培养基的速度最快,其次为培养基6,但各组间没有显著性差异;大部分培养基菌丝转色时间都为3~4 d,其中培养基1转色最快,平均2.83 d,极显著快于第3、4、9、10组(p<0.01);培养基1的子实体成熟时间最短,但各组间没有显著性差异。可见,培养基1长势最好,生长周期最短。各处理组子实体成熟图见图1。
图1 蛹虫草成熟子实体图Fig.1 Mature fruiting bodies of Cordyceps militaris
表4 不同培养基蛹虫草的生长情况Table 4 Effects of different medium on the growth of Cordyceps militaris
由表5可知,不同配方培养蛹虫草,对子实体生产性能影响很大。子实体鲜重最重的是培养基6,为31.81 g,而培养基3最低,为17.71 g,二者与其他组存在极显著差异(p<0.01)。子实体干重量以培养基1最高达4.66 g,与除培养基6之外的其余各组存在极显著差异(p<0.01)。干物质百分比最高的为培养基1,为17.18%,极显著地高于其他组(p<0.01),其次为培养基3,而最低为培养基8,且培养基8干物质百分比与第1、3、4、5和10组培养基差异极显著(p<0.01)。生物转化率仍然是第1组培养基最高,为18.64%,极显著高于除培养基6以外的其他各组(p<0.01)。
表5 不同培养基蛹虫草的生产性能Table 5 Effects of different medium on productivity of Cordyceps militaris
由图2可知培养基3糙米粥的颜色评分最高,其次为培养基1和培养基5;在风味上,培养基8接受度最高,其次为培养基3和培养基1;滋味同样是培养基3得分最高,滋味酸甜最为可口,其次为培养基1和培养基6,都有酸味,较可口;综合来看,培养基3、1、8的总评分分别排第1、2、3名,而培养基6与培养基8总分非常接近,有较高的接受度。培养基2的各项评分均为最低值,可见其色、香、味最不受欢迎。
图2 蛹虫草杂粮粥的感官评价雷达图Fig.2 Sensory evaluation radar map of Cordyceps militaris coarser grains porridge注:1~10为10组不同培养基。
表6 感官评定滋味评语Table 6 Comment of sensory taste evaluation
根据上述生产性能成绩和感官评价结果,培养基1和培养基6的子实体产量、生物转化率水平高,而培养基3的感官评价得分最高,培养基1和培养基6感官评价水平较高,故选取培养基1、3、6这3组进一步进行子实体活性物质测定和培养基滋味物质分析。
由表7可知,培养基6子实体的腺苷含量显著高于其余两组(p<0.05),分别为培养基1、3的2.50和3.34倍;子实体虫草素含量也是培养基6最高,显著高于培养基1和3(p<0.05),极显著高于培养基1(p<0.01)。
表7 不同培养基培养蛹虫草子实体腺苷、虫草素含量Table 7 Adenosine and Cordycepin content of Cordyceps militaris fruit body cultured by different medium
由图3和表8、表9可知,收获子实体后,培养基1、3、6中均检测到了17种水解氨基酸,TAA含量以处理6最高,处理3最低。培养基1、3、6中含量最多的氨基酸均为脯氨酸,其次均为谷氨酸,含量第3高的分别为精氨酸、精氨酸和甘氨酸,而含量最低的分别为组氨酸、组氨酸和蛋氨酸。3组EAA占TAA百分比在33.33%~35.78%之间,培养基1、3、6中呈味DAA占TAA的百分比分别为97.68%、95.92%和97.82%,培养基1和培养基6的甜味DAA占TTA的百分比最高,分别为41.15%和45.68%,其次为苦味DAA,占比分别为39.30%和37.47%;培养基3的苦味DAA占比最高为41.87%,其次是甜味DAA,占比为34.67%;各培养基鲜味DAA占比最低。各组呈味氨基酸的TAV值都大于1,且TAV最大的均为呈鲜味的谷氨酸,分别为43.03、33.60和46.95,各组呈苦味氨基酸中的组氨酸、精氨酸、缬氨酸和蛋氨酸TAV贡献较大,而TAV值最小的均为呈甜味的苏氨酸。
图3 培养基中氨基酸组成及含量Fig.3 Composition and content of amino acids in medium
表8 培养基中氨基酸滋味活度值Table 8 The taste attributes,taste thresholds and TAVs of amino acid in medium
表9 培养基中氨基酸分类与比例Table 9 The category and ratio of amino acid in medium
从图4和表10可以看出,核苷酸总量最高的是培养基3,为10.012 mg/100 g,培养基1和培养基3核苷酸总量相近,分别为1.8923和1.909 mg/100 g。培养基3肌苷酸(IMP)含量远远高于培养基1和培养基6,且其呈鲜核苷酸(IMP、鸟苷酸GMP总和)含量最高,分别为培养基1和培养基6的8.02倍和4.56倍。甜味核苷酸腺苷酸(AMP)含量也是培养基3最高,为培养基1的1.51倍,而培养基6未检测出。各培养基不同核苷酸的TAV值均小于1。
图4 培养基中核苷酸组成及含量Fig.4 Composition and content of nucleotide in medium
表10 培养基中核苷酸滋味特征、阈值及滋味活度值Table10 The taste attributes,taste thresholds and TAVs of nucleotide in medium
由图5和表11可知,培养基1的有机酸总量最高,为1089.942 mg/100 g,其次为培养基6,为808.551 mg/100 g,培养基3的有机酸含量最低,仅134.294 mg/100 g,各组之间差异较大。
图5 培养基中有机酸组成及含量Fig.5 Composition and content of organic acid in medium
表11 培养基中有机酸滋味特征、阈值及滋味活度值Table 11 The taste attributes,taste thresholds and TAVs of organic acid in medium
在检测的6种有机酸中,培养基1检测出4种,培养基3检测出3种,培养基6检测出4种。只有苹果酸、草酸在各组中均被检测到,且都在培养基1中含量最高;琥珀酸在培养基3中未被检出,在其他两处理中含量较高;而柠檬酸、酒石酸和乳酸分别只在第1、3、6组培养基中被检出。除培养基3的草酸外,其余所有检出的有机酸TAV值都大于1,表明都对呈味有较大贡献。培养基1的琥珀酸TAV值最高,其次为苹果酸,分别为19.65和12.49;培养基3的酒石酸TAV值最高,为7.27;培养基6的琥珀酸TAV最高,达30.09,也是所有TAV中最高值。
培养基是影响微生物生长及代谢的重要因素之一,最佳培养基配比可促进蛹虫草子实体生长[25-26]。本研究中,蛹虫草接种在燕麦培养基上发菌、转色、子实体成熟用时最短;复合培养基6(燕麦仁5 g+糙米5 g+黄豆5 g+莲子10 g)发菌、转色速度紧随其后。同样,在生产性能方面,培养基1和6都表现出较强的优势。可见,该两组培养基,蛹虫草生长发育快、子实体产量高,在蛹虫草生长方面表现优于其他单一或复合配方。而糙米培养基培养的蛹虫草子实体成熟最晚、产量最低,这可能与本单位培养蛹虫草以小麦培养基为主有关,在长期的菌种选育过程中,使菌种逐渐适应麦类基质,而不适于米类基质,使得在单一糙米培养基上生长情况和生产性能表现均不佳。
不同培养基培育蛹虫草活性物质含量有较大差别[26]。在检测的3组子实体中,处理6活性物质含量显著高于燕麦和糙米培养,可见复合配方较单一组分能为蛹虫草菌种提供较为全面的营养物质。在实际生产中,可开发复合培养基配方,以提高蛹虫草子实体的品质。
美拉德反应又称非酶褐变反应,主要指食品加工和贮藏过程中羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)之间发生的复杂化学反应的总称[27]。食物在高温烹饪过程中发生美拉德反应,从而产生风味物质及色泽的改变。影响美拉德反应的因素除糖和氨基化合物的种类、浓度外,还受温度、pH、时间、水分活度等因素的影响[28]。本研究中各组培养基由于组分不同,其氨基酸组成、还原糖含量亦有差异,加之经高温高压灭菌后,各种杂粮组分发生了不同程度地褐变及风味的改变,对培养基感观评定产生影响。褐变最明显的组分是莲子,由白色变成褐色,含有莲子的培养基颜色普遍加深,在感观评定中接受度较低;糙米培养基色泽浅黄,更易让人产生食欲。因此,在颜色评分中,第3组、第1组和第5组分列前3位。杂粮粥受原料组成、加热温度及发酵等因素影响,其挥发性风味物质、滋味物质种类及相对含量不同。糙米和燕麦培养基粥口感酸甜、气味怡人,复合培养基中第6组的滋味评分和第8组的气味评分较高,都是酸味略带苦味,有较高的接受度,具有食品开发前景。
氨基酸是构成蛋白质的基本单位,燕麦、糙米、黄豆和莲子中蛋白含量分别为14.4%、8.07%、35.0%和17.2%左右,因此,其蛋白质水解后获得AA差别较大。本研究中,第6组培养基中TAA最高,与添加含蛋白质较高的黄豆和莲子有关,其次为第1组,第3组最低。本试验得到第1组燕麦培养基中含量最高的5种氨基酸从大到小为:脯氨酸>谷氨酸>甘氨酸>精氨酸>亮氨酸,这与李笑蕊等研究有所不同,其对6种燕麦氨基酸含量分析后发现,谷氨酸>天冬氨酸>丙氨酸>亮氨酸>精氨酸[29]。本试验糙米培养基残基含量最高的5种氨基酸从大到小为:谷氨酸>脯氨酸>精氨酸>亮氨酸>苯丙氨酸,而高丽红研究认为糙米中含量较高的为谷氨酸>天冬氨酸>亮氨酸>丙氨酸>缬氨酸[30],培养基1、3与未处理的燕麦和糙米相比,氨基酸含量大小顺序不同的原因可能是与本试验培养基经过发酵,发生营养素重组有关。
第1、3、6组培养基呈味DAA分别占TAA的97.68%、95.92%和97.82%,由此可知各组DAA含量非常丰富。氨基酸分成鲜、甜和苦3类[31],各组甜味DAA和苦味DAA占比较高,鲜味DAA占比最低。DAA的TAV越大,呈味作用越显著,对滋味的贡献越大[32]。各呈味氨基酸的TAV值都大于1,表明每种DAA对整体滋味的形成均有一定的贡献。谷氨酸是重要的鲜味剂[33],各处理组TAV最大的都是谷氨酸,分别为43.03、33.65、46.95,在DAA中谷氨酸鲜味最强,为最主要的呈味氨基酸。TAV值较大的还有呈苦味的精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和组氨酸,其中精氨酸有增加呈味复杂性和提高鲜度的作用[34]。
本研究在预试验中检测了燕麦和糙米中核苷酸含量,其中燕麦中IMP、GMP、AMP含量分别为低于检测限、0.978和0.638 mg/100 g,糙米中IMP、GMP、AMP含量分别为4.279、0.755和0.539 mg/100 g,虽然在原料和配方中呈味核苷酸含量都较低,但培养基3发酵后检测其IMP浓度远高于其他两组,这可能与未发酵糙米中IMP含量远高于燕麦有一定关系。在培养基6中糙米占比20%,因而培养基6的IMP浓度也大幅高于培养基1。
核苷酸是产生鲜味的重要化合物,其中以IMP、GMP的鲜味最强,最为重要。除此之外,核苷酸还具有以下特点:对甜味有增效作用,对咸味、苦味、酸味、焦味有消杀作用[35]。相关研究已经证实AMP和IMP具有协同增效作用[35],当存在低浓度的 IMP 时,AMP 不仅会呈现鲜味,同时甜味也会增强。同时,少量IMP存在条件下,可以显著的提高甘氨酸、丙氨酸的甜味[36]。本实验测得3组培养基中呈味核苷酸的TAV值未超过1,但核苷酸之间、核苷酸和氨基酸之间均具有协同增效作用,其富含的谷氨酸、甘氨酸等与核苷酸协同作用后,会大大增加鲜味,也可以改善甜味、鲜味和总体风味[37]。
本研究预试验时检测了燕麦和糙米中上述6种有机酸含量,燕麦中检测到的有机酸包括苹果酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸,含量依次为63.45、24.11、274.46、150. 50、21.15 mg/100 g;糙米中检测到的有机酸包括草酸、琥珀酸、柠檬酸,含量依次为15.41、119.54、68.53 mg/100 g。可以看出,培养基发酵后草酸、苹果酸含量呈大幅增长趋势,其中燕麦中苹果酸含量增长了近10倍,糙米中苹果酸从无到有,增长幅度较大;发酵后燕麦培养基中琥珀酸、柠檬酸含量呈一定下降趋势,而糙米培养基中这两者大幅降低,降到低于检测限,但培养基6中琥珀酸含量较高,可能与其中黄豆、莲子本身琥珀酸含量较高,或较高的转化率有关。
培养基1、6有机酸总量远高于培养基3,并且有机酸TAV值也是培养基1和6较大,二者总TAV值较为接近,其中苹果酸、琥珀酸TAV对培养基1的贡献与琥珀酸对培养基6的贡献相当。结合感官评价,培养基1呈爽口的酸味,培养基6酸味略带苦味,而培养基3酸味轻淡,可见,有机酸及其较高TAV值对各组呈味产生重要影响[23]。琥珀酸是有机酸的主要鲜味组分,呈酸味并带有鲜味[38]。琥珀酸与鲜味氨基酸存在一定的协同效应;当少量琥珀酸与谷氨酸钠(MSG)作用时,产生强烈的增鲜效应[39]。本研究中各组谷氨酸占有较大比重,可与琥珀酸协同发挥作用,所以可以认为琥珀酸对培养基1、6的酸味和鲜味有较大的贡献。酒石酸呈有刺激的酸味,在培养基3中TAV贡献最大,然而培养基3的培养基口感醇和,并无明显刺激味,可见,各呈味物质综合发挥了作用。
综合子实体生产性能、活性物质含量,以及培养基杂粮粥感官评价指标分析结果,三组配方性状优良。采用燕麦培养基和复合培养基(燕麦仁∶糙米∶黄豆∶莲子=1∶1∶1∶2),具有子实体生长速度快、生产性能高、活性物质含量丰富及培养基杂粮粥口感较好的特点,而糙米培养基子实体产量较低,但其杂粮粥感官评价最好。上述三组培养基配方具备开发功能食品的潜力,本研究为提高蛹虫草子实体生产性能及培养基开发利用提供了理论依据。