长链非编码RNA PTV1通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭及诱导凋亡

钟丽颖，李顺东，孙叶海

长沙市第三医院 老年病科 (长沙 410015)

甲状腺癌(thyroid cancer, TC)是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，约占所有癌症的1%[1]。TC可分为乳头状、滤泡状、髓质状和间变性亚型，其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer, PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤，占75%～85%[2-3]。尽管TC的5年生存率可以达到95%，但是仍有部分PTC患者预后较差[4]。因此，探索PTC恶性进展过程中的分子机制、寻找新的、有效的治疗靶点对防治PTC具有重要意义。近年的研究表明，长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)在胃癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、前列腺癌[8]及甲状腺癌[9]等多种肿瘤中异常表达，且参与肿瘤的生长、侵袭转移等生物学过程。本研究旨在探讨LncRNA-PVT1对PTC细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂

人正常甲状腺细胞株HT-ori3(北纳创联生物技术有限公司)及人甲状腺癌细胞株IHH-4(PTC)、FTC-133、8505C购自中国科学院上海细胞生物研究所。RPMI-1640培养基和胎牛血清(Gibco公司，美国)；1%青霉素-链霉素(南京碧云天公司，中国)；CCK-8试剂盒和凋亡检测试剂盒(同仁公司，日本)；Transwell小室(Corning公司，美国)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；RNA提取试剂盒及反转录试剂盒(Sigma，美国)；PVT1引物、PVT1-siRNA及阴性对照载体(上海生工，中国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 分别将HT-ori3(n=6)、IHH-4(n=6)、FTC-133(n=6)及8505C(n=6)细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱常规培养。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR) 按照试剂盒操作说明，使用Trizol法提取细胞总RNA，并使用反转录试剂盒进行cDNA合成。以cDNA模板进行PCR扩增，以GAPDH为内参进行荧光定量PCR。所用引入序列为：LncRNA-PTV1上游5'-TGAGAACTGTCCTT ACGTGACC-3'，下游5'-AGAGCACCAAG ACTGGCTCT-3'；GAPDH上游5'-GGGTGGAG CCAAACGGGTC-3'，下游5'-GGAGTTGCT GTTGAAGTCGCA-3'。 采用荧光定量PCR仪Mx3006P进行定量检测，目的基因的定量分析采用 2-△△Ct方法进行计算。

1.2.3 细胞转染 根据qRT-PCR结果选择PTC细胞进行后续实验。取对数生长期的PTC细胞接种于6孔板，接种密度为3.0×105个/孔，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养，待细胞生长至80%时进行转染实验。将PCT细胞随机分为3组，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书进行转染操作，分别转染PTV1-siRNA沉默载体(PTV1-siRNA组，n=6)、PTV1-siRNA空表达载体(siNC组，n=6)及空白对照PBS(Blank组，n=6)。转染48 h，qRT-PCR检测转染效率，其方法参照1.2.2实验步骤。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖 取对数生长期的IHH-4细胞，胰酶消化成单细胞悬液，以3×103个/孔接种于96孔板中，每组设置6个复孔，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养，分别于接种后24、48和72 h加入CCK-8溶液(5 g/L)，20 μL/孔，继续培养2 h后，于450 nm处使用酶标仪测定各孔细胞的吸光度(OD)值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞转染48 h后，收集各组细胞并用预冷的PBS洗涤，加入100 μL结合缓冲液(binding buffer)重悬细胞，再分别加入用荧光抗体FITC标记的磷脂结合蛋白V试剂盒(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium lodide)各5 μL，轻轻混匀后避光室温孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 细胞迁移侵袭(Transwell)实验 收集各组转染细胞重新悬浮于无血清培养基中，取细胞悬液接种于Transwell 的上室，接种密度为5×104个/孔，在小室下层孔中加入750 μL含血清的培养液，将Transwell小室置入37 ℃、5%的CO2培养箱培养48 h，小心拭去未穿透的细胞及Matirgel胶，4%甲醛固定，结晶紫染色。在显微镜下(40×)计数5个单独视野的穿膜细胞数。

1.2.7 蛋白质印迹技术(Western Blot)检测蛋白表达水平 细胞转染培养48 h后，收集细胞并使用细胞裂解液(RIPA)进行裂解，提取总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白含量。根据蛋白浓度检测结果，取20 μL 蛋白样品进行 Western blot 检测。配制10% SDS-PAGE分离胶，利用 5% 的脱脂奶粉封闭液室温下封闭 2 h，一抗 4 ℃ 孵育过夜，二抗孵育 1 h，ECL显影，拍照后计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PTV1在甲状腺癌细胞株中的表达情况

qRT-PCR检测结果显示，与正常甲状腺细胞株相比，甲状腺癌细胞株IHH4(PTC)、FTC133、8505C中PTV1表达水平明显升高，且IHH-4中PTV1表达水平明显高于FTC133和8505C，差异具有统计学意义(F=98.59，P<0.001)(图1)。

图1 LncRNA PTV1在甲状腺癌细胞株中的表达

注：与HT-ori3相比较，*P<0.05；与IHH-4相比较，#P<0.05

2.2 qRT-PCR检测转染效率

转染48 h后，qRT-PCR检测结果显示：si-PTV1组PTV1 mRNA表达水平明显低于Blank组和siNC组，差异具有统计学意义(F=110.97，P<0.001)。结果说明转染效果较好(图2)。

图2 qRT-PCR检测细胞转染效率注：与si-PTV1相比较，*P<0.05

2.3 沉默PTV1表达对细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示：细胞转染48 h后，si-PTV1组细胞活性明显受到抑制，与Blank组和siNC组相比较，差异具有统计学意义(F=9.20，P=0.015，P<0.05)；且细胞转染72 h后，si-PTV1组细胞活性与Blank组和siNC组差异更明显(F=30.92，P=0.001)。结果说明沉默lncRNA PTV1的表达可抑制细胞增殖(图3)。

图3 CCK-8实验检测沉默PTV1表达对IHH-4细胞增殖的影响

注：与si-PTV1相比较，*P<0.05

2.4 沉默PTV1表达对细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示:si-PTV1组细胞凋亡率明显增加，与Blank组和siNC组相比较，差异具有统计学意义(F=50.87，P<0.05)。结果提示沉默lncRNA PTV1的表达可促进细胞凋亡(图4)。

图4 流式细胞术检测沉默PTV1表达对IHH-4细胞凋亡的影响
注：A：流式细胞图；B：细胞凋亡率，与si-PTV1相比较，*P<0.05

2.5 沉默PTV1表达对细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示：si-PTV1组穿膜细胞数明显减少，与Blank组和siNC组相比较，差异具有统计学意义(F=21.73，P=0.002)。该结果说明沉默lncRNA PTV1的表达可抑制细胞的侵袭能力(图5)。

2.6 沉默PTV1表达对Wnt/β-catenin信号通路的影响

与Blank组和siNC组相比较，si-PTV1组Wnt信号通路蛋白β-catenin(F=14.62，P=0.005)、cyclin D1(F=38.39，P<0.001)及c-myc(F=40.61，P<0.001)的相对表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。此结果说明沉默lncRNA PTV1的表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路(图6)。

图5 Transwell迁移实验检测沉默PTV1表达对IHH-4细胞侵袭能力的影响

注：A：Blank组显微镜下穿膜细胞；B:siNC组显微镜下穿膜细胞；C：si-PTV1组显微镜下穿膜细胞；D：穿膜细胞数，与si-PTV1比较，*P<0.05

图6 Western blot检测抑制PTV1表达对β-catenin、cyclin D1及C-Myc蛋白表达水平的影响注：A：Western blot检测β-catenin、cyclinD1及c-myc蛋白表达；B：蛋白相对表达水平，与si-PTV1相比较，*P<0.05

3 讨论

长链非编码RNA (long noncoding RNA，LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸、但无蛋白编码功能的RNA，其在表观遗传学修饰、转录调控、细胞增殖和凋亡等多种生物过程中发挥重要作用[10]。人LncRNA PTV1是小鼠浆细胞瘤位变异位点基因1(plasma-cytoma variant translocaion gene 1)的同源基因，位于染色体8q24区，长670bp[11]。近年的研究[12]表明，PTV1在多种肿瘤组织或细胞系中高表达，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，抑制凋亡，发挥类似癌基因的作用。Li等[13]研究证实，LncRNAs在甲状腺肿瘤发生过程中发挥重要作用。Zhou等[14]研究表明，PTV1在84个甲状腺癌组织和细胞株中呈现高表达，抑制PTV1表达可明显抑制甲状腺癌细胞株的生长，其机制可能与降低细胞周期蛋白D1的表达有关。本研究发现：甲状腺癌细胞株中LncRNA PTV1的表达水平明显高于人正常甲状腺细胞株HT-ori3，与上述文献[14]报道的一致，提示PTV1可能是甲状腺癌的一个潜在独立的诊断标志；沉默PTV1的表达能够减弱甲状腺癌细胞株IHH-4的增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡，提示PTV1可能参与甲状腺癌的发生发展过程。

Wnt信号通路于1982年被发现，其是一个复杂的蛋白质作用网络，参与细胞增殖、分化、凋亡、迁移及侵袭等多种生物过程，并且在胚胎发育过程及动物肢体形成过程中发挥重要作用[15]。研究[16-17]表明Wnt信号通路相关分子在多种肿瘤细胞中异常表达。邹慧娟等[18]研究发现：激活后的Wnt信号通路可通过β-catenin上调细胞增殖相关因子c-myc和cyclin D1的水平促进结肠癌细胞的增殖，提示Wnt信号通路参与肿瘤细胞的发生。新近研究[19]表明PTV1可通过Wnt信号通路调控卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。研究[20]发现抑制Wnt/β-catenin信号通路可降低甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。本研究发现：沉默PTV1的表达能够降低PTC细胞株中Wnt信号通路相关蛋白β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达水平，提示PTV1可通过调控Wnt信号通路参与甲状腺癌细胞的增殖、侵袭及凋亡过程。

综上所述，本研究证实了LncRNA PTV1在甲状腺癌细胞中高表达，沉默PTV1表达能够抑制PTC细胞增殖和侵袭、促进凋亡，其作用机制可能与降低Wnt信号通路相关蛋白的表达水平有关。本研究结果提示LncRNA PTV1可作为PTC治疗的潜在靶点，但其发挥作用的具体机制还需深入研究。