四种结核分枝杆菌检测方法临床诊断效能的评价

代小伟 陈双双 杨新宇 赵琰枫 田丽丽 易俊莉 陈昊 丁北川

结核病病原学检查是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和选择化疗方案的重要依据。世界卫生组织[1]在《2018年全球结核病报告》中指出，2017年全球约有1000万例新发结核病患者，其中有640万例新发患者被正式通报给国家有关部门，估计数与报告数之间的差距，主要是由于病例漏报以及漏诊造成的。为减少漏报和漏诊，提高细菌学检查阳性率，中华人民共和国国务院办公厅[2]发布了《“十三五”全国结核病防治规划》，要求肺结核患者病原学阳性率要达到50%以上。本研究采用痰涂片抗酸染色镜检(简称“涂片法”)、L-J培养基(Lowenstein-Jenden medium)固体培养(简称“L-J法”)、BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960法”)及GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert法”)等4种方法对疑似肺结核患者痰标本进行检测，比较和评价4种方法单独检测及联合检测的诊断效能。

材料和方法

一、一般资料

本研究选取2018年1月1日至2018年12月31日就诊于北京结核病控制研究所门诊的451例疑似肺结核患者(样本数量达到诊断性试验样本量的要求)，每例患者留取痰标本，同时完成3次涂片法、2次L-J法、1次MGIT 960法和1次GeneXpert法检测。并对固体或液体培养物用PCR方法进行初步菌群鉴定，对非结核分枝杆菌(NTM)进行微阵列基因芯片检测。

二、仪器和试剂

萋-尼抗酸染色染液由珠海贝索生物技术有限公司生产，酸性罗氏培养基由河南赛诺特生物技术有限公司生产，MGIT 960全自动结核分枝杆菌快速液体培养仪及其配套试剂由美国BD公司生产，GeneXpert MTB/RIF核酸检测仪及试剂由美国Cepheid公司生产。PCR-荧光探针法检测使用Roche LightCycler 480仪，试剂由北京博奥晶典生物技术有限公司生产。晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(微阵列基因芯片法)、核酸提取仪ExtractorTM36、晶芯微阵列芯片扫描仪LuxScan-10K/B、晶芯芯片杂交仪BioMixerTMⅡ、晶芯SlideWasherTM8芯片洗干仪均购自博奥生物有限公司。

三、检测方法

1.涂片法：采用萋-尼抗酸染色，按照《结核病实验室检验规程》[4](简称“《规程》”)进行痰涂片抗酸染色镜检及结果判读。同一例3份完成涂片的标本中，任何一份发现抗酸杆菌即判定为涂片阳性。

2.L-J法：按照《规程》，将痰液用4%NaOH以1∶1比例进行消化处理，15 min后取0.1 ml接种到酸性罗氏培养基中。每周观察1次培养基，发现菌落生长后挑取菌落完成涂片，菌落经抗酸染色镜检阳性者报培养阳性；2个月未见菌落生长报告阴性。同一患者2份完成固体培养的标本中，任何一份发现抗酸杆菌生长即判定为L-J检测阳性。阳性菌落进行抗酸染色镜检，确定菌纯度，同一份标本GeneXpert法检测阴性而L-J法培养阳性的菌株，进行PCR检测，做初步菌群鉴定。

3.MGIT 960法：严格按照BACTEC MGIT 960系统操作说明书进行操作，吸取0.5 ml痰标本加入到50 ml圆底离心管内，再加入1～2 ml前处理液(NALC-NaOH)，震荡消化15 min，加入40 ml 磷酸盐缓冲液(PBS)中和离心(3000×g离心18 min),弃上清，加1 ml的PBS进行重悬沉淀，取0.1 ml接种到准备好的培养管内。培养阴性结果报告时间设定为满42 d。仪器报告阳性后，取培养液进行抗酸染色镜检，确定菌纯度，同一份标本GeneXpert法检测阴性而MGIT 960法培养阳性的菌，进行PCR检测，做初步菌群鉴定。

4.GeneXpert法：检测严格按照说明书操作，取1 ml痰标本，加入2 ml标本处理液，震荡混匀，静置15 min后，吸取2 ml液化标本于反应盒内，将加好标本的反应试剂盒放到检测仪内，开始自动检测，反应结束后在检测系统窗口下直接观察测试结果。

5.PCR检测：对GeneXpert 法检测阴性，且其他3种方法检测阳性的患者菌株进行PCR荧光探针法检查，挑取少量菌落入80 μl核酸提取液，充分涡旋后放入核酸提取仪，最大转速震荡5 min，95 ℃水浴5 min， 离心半径8.2 cm，5000 r/min 离心1 min；取上清2 μl入扩增反应液，上机。样本扩增曲线为S型，Ct值<40判定为阳性。

6.微阵列基因芯片：PCR检测鉴定为NTM的菌株，进行微阵列基因芯片检测。在核酸提取管中加入50 μl 核酸提取液，挑取单个菌落放入核酸提取仪，最大转速震荡5 min后95 ℃水浴5 min，5000×g离心1 min；将2 μl提取出来的DNA 加入至18 μl反应体系中，按晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒说明书进行扩增、变性，从盖片的加样孔中加入14 μl杂交反应物；盖上杂交盒并密封，将密封好的杂交盒水平放入50 ℃的芯片杂交仪中杂交2 h，记录芯片的编号、微阵列位置及对应的样本编号；待杂交反应结束后将芯片从杂交盒中取出，用十二烷基硫酸钠洗液和柠檬酸钠洗液冲洗干净，甩干后放入芯片扫描仪，用晶芯结核分枝杆菌检测芯片系统判读芯片结果。

四、质量控制

1.抗酸染色镜检质量控制：(1)相应检验项目按照《规程》相关规定，完成室间质量评估，项目质量合格。(2)相应检验项目按照《规程》相关规定，建立并严格执行室内质量保障体系相关规定。

2.痰培养质量控制：(1)固体培养质量控制。每批培养基进行无菌性测试和敏感性测试；培养基在冷藏条件下不超过2个月。(2)液体培养质量控制。每月打印质量控制报告；每批MGIT培养管进行常规质量控制检测(使用结核分枝杆菌H37Rv菌液制备)。

3.GeneXpert法质量控制：每个检测匣定期进行样品处理质量控制(SPC)和探针质量控制(PCC)，以确保样品经过正确处理和探针符合指定的接受标准，保证检测系统合格。

4.PCR质量控制：检测中同时提取试剂盒内提供的阳性对照和阴性对照液体的DNA，并与样品同时检测，确保实验结果的准确性。

5.微阵列基因芯片质量控制：检测中同时扩增试剂盒内提供的阳性对照和阴性对照DNA，与样品同时检测，确保实验结果的准确性。

五、统计学处理

所有检测项目结果、患者基本信息及患者临床诊断结果，采用SPSS 17．0统计软件进行统计分析，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、临床诊断结果

451例疑似肺结核患者痰标本性状分布：889份为黏液痰，12份为干酪痰，37份为血痰，415份为唾液，合格痰标本占69.3%(938/1353)，不合格标本占30.7%(415/1353)。根据临床症状、胸片及实验室检查项目结果，按照《WS 288—2017肺结核诊断》标准[5]进行诊断。451例可疑肺结核患者中，临床最终诊断为肺结核患者227例(肺结核225例、肺结核并发结核性胸膜炎2例)，非肺结核患者224例(NTM肺病11例，陈旧性肺结核6例，肺部阴影待查181例，胸腔积液3例，肺纤维化1例，肺炎3例，肺癌1例，密切接触者筛查18例)。其中NTM肺病患者先经过PCR检测确定为NTM，再取患者2次培养阳性菌株进行微阵列基因芯片检测，2次检测结果为同一种NTM者，最终诊断为NTM肺病。

二、各方法单独检测及联合检测的诊断效能比较

1.本研究4种方法单独检测的诊断效能比较：以临床诊断为参考标准判断4种方法单独检测的诊断效能结果见表1。从表1可以看出，4种检测方法的敏感度与一致率从高到低的排位顺序为MGIT 960法、GeneXpert法、L-J法、涂片法。

对4种检测方法的诊断敏感度进行检验，L-J法检出率高于涂片法，差异有统计学意义(χ2=232.612,P<0.01)；GeneXpert法检出率高于L-J法，差异有统计学意义(χ2=211.335，P<0.01)；MGIT 960法检出率明显高于GeneXpert法，差异有统计学意义(χ2=213.736，P<0.01)。4种方法与临床诊断的一致率均在59.0%～69.0%之间。

2.本研究4种方法检测后联合判断的诊断效能比较：对3组联合检测方式的诊断敏感度进行检验，3种方法联用的检测敏感度高于2种方法联用，差异有统计学意义(χ2=155.807,P<0.01)；4种方法联用的检测敏感度高于3种方法联用，差异有统计学意义(χ2=176.173，P<0.01)，4种方法联用的检测敏感度最高，与临床诊断的一致率较4种方法单独检测高10%左右(表2)。

表1 以临床诊断为参考标准判断4种方法单独检测的诊断效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/样本总例数

表2 以临床诊断为参考标准判断4种方法检测后联合判断的诊断效能

注2种方法联用：涂片法和L-J法联用；3种方法联用：涂片法、 L-J法 和GeneXpert法；4种方法联用：涂片法、L-J法、GeneXpert法和MGIT 960法联用。敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/样本总例数

3.涂阴疑似肺结核患者中L-J法、GeneXpert 法以及MGIT 960法的检出情况：227例肺结核患者中，涂片法检测阴性为176例。涂阴的标本中，用L-J法检出阳性28例，阳性检出率为15.9%；用GeneXpert法检出阳性40例，阳性检出率为22.7%；用MGIT 960法检出阳性52例，阳性检出率为29.5%。GeneXpert法与L-J法对涂阴结核病的阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=44.599，P<0.01)；MGIT 960法与GeneXpert法比较，差异有统计学意义(χ2=56.693，P<0.01)。

讨 论

2017年11月9日，中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会颁布了《WS 288—2017 肺结核诊断》。将分枝杆菌核酸检测和液体培养均纳入了结核病病原学检查范畴[5]。本研究选取门诊疑似肺结核患者痰标本，进行涂片法、L-J法、MGIT 960法和GeneXpert等4种病原学方法检测。涂片法简单快捷，成本低易普及，目前仍是国内最主要的患者发现方法和随访时疗效的监测手段[6-7]。但涂片法阳性检出率低，在本组结核病患者中检测敏感度为22.5%(51/227)，难以满足临床诊断的需求。从结核病控制、流行病学调查研究和临床诊断与治疗的角度看，分枝杆菌的分离培养是结核病病原学诊断的“金标准”[8]。但结核分枝杆菌生长缓慢耗时长，需5～8周时间，明显滞后于临床医师对肺结核早期诊断的期望[9]。

2010年WHO即推荐使用GeneXpert MTB/RIF分子诊断技术，其基于半巢式定量PCR扩增过程，在一个封闭的试剂盒中自动完成，可在2 h内完成检出结核分枝杆菌的同时，可检测结核分枝杆菌对利福平的耐药基因是否发生突变[10]，进而为判断是否存在利福平耐药提供参考依据；该检测方法对结核病的诊治具有里程碑式的意义[11]。本研究中GeneXpert法检测的敏感度明显高于涂片法和L-J法，与赵冰等[12]、周喜桃等[13]的研究结果一致，并以该检测方法具有快速、简单、敏感度高、对生物安全要求不高且能同时检测对利福平的耐药情况等优点，推荐其在基层实验室使用和推广。1977年美国BD公司研制出基于液体培养的BACTEC分枝杆菌全自动检测系统。与固体培养相比，目前的MGIT 960系统,在操作步骤上除了去污染试剂相对“温和”且更高效外，还调整采用了中和离心集菌等接种前的处理步骤，明显提高了分枝杆菌分离培养阳性率；同时由于在专用7H9培养管中加入含有Ruthenium的荧光底物，当细菌生长时，通过细菌代谢监测底物激发产生荧光，也缩短了阳性结果的判定时间。本研究中，MGIT 960法检测的敏感度最高达43.2%，与Zhao等[14]的研究结果相符。4种检测方法中，GeneXpert法和MGIT 960法的敏感度明显高于传统的涂片法和L-J法。

目前，大部分基层医院以传统抗酸染色镜检为结核病患者的主要发现手段，阳性率仅在25%左右，仍有75%的涂阴肺结核疑似患者面临诊断问题[15]。本研究总结了涂阴结核病患者分别用L-J法、GeneXpert法和MGIT 960法检测后，阳性检出率均有不同程度的提高，其中L-J法和MGIT 960法对涂阴肺结核的检出率与张娟等[16]的研究结果相近，较郭新枝等[17]的研究结果低近1倍，分析原因可能与痰标本的质量有关系。杨新宇等[3]研究显示，痰标本的质量与检测阳性率有着密切的关系；郭新枝等[17]的研究中，研究对象均为住院患者，其在医护人员指导和监视下留痰的质量比较高；而本研究的研究对象均为门诊患者，痰标本质量不易控制，其中不合格标本占30.7%。

为掌握结核病临床诊断病原学依据，满足结核病防治工作的要求，已有很多报告尝试和研究将不同检测方法进行联合检测[18-21]。根据《“十三五”全国结核病防治规划》要求，肺结核患者病原学检测阳性率要达到50%以上。按照北京市各区(县)结核病检测实验室的实际情况，本研究将病原学检测方法进行3种组合，并比较其诊断效能。传统涂片法和L-J法联合应用时，阳性率为34.8%,检出效率不如单独应用GeneXpert法或MGIT 960法高；将GeneXpert法与涂片法和L-J法联合应用时，病原学阳性率提高到43.6%；而将涂片法、L-J法、GeneXpert法和MGIT 960法联合应用时，病原学阳性率可达到49.8%；如果加强对结核病患者进行宣传教育，引导其正确地留取高质量痰液标本，必然能达到国家《“十三五”全国结核病防治规划》关于病原学检测阳性率达到50%以上的要求。虽然液体培养仪器和实验操作步骤略复杂，前处理有集菌过程，对实验人员和实验环境要求都比较高，但鉴于MGIT 960法对病原学阳性率的贡献，以及其培养时间较短、阳性培养物可后续进行分子及表型药物敏感性试验等优点，仍应鼓励有条件的区(县)结核病检测实验室积极开展液体培养。

本研究结果显示，以临床诊断为参考标准，MGIT 960法检测的敏感度、一致率最高，GeneXpert法特异度最高。有研究主张用GeneXpert、离心浓缩涂片法及MGIT 960法取代传统的涂片及培养[22]，笔者认为在不同条件的检测实验室，各种检测方法均占有重要的地位，检测中不能互相代替。为更好地服务患者、服务临床，以及提高病原学阳性率、减少漏诊，建议将上述4种病原学检测方法联合应用，以实现各种检测方法诊断效能的最大化。