Etest方法与微量肉汤稀释法检测念珠菌属对唑类抗真菌药物的敏感性评价*

张 丽，王 贺，肖 盟，徐英春

(1.中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730；2.侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730)

近年来念珠菌感染的发病率逐渐增加，成为引起院内感染的重要致病菌[1-2]。唑类药物是用于治疗念珠菌感染常用药物，但随着临床抗真菌药物的广泛使用，开始出现耐药菌株，因此及时准确的体外药物敏感性检测对于指导临床抗真菌治疗具有重要的意义[3-4]。美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的微量肉汤稀释法(broth microdilution method，BMD)为金标准，但操作繁琐，耗时耗力，限制了其在临床中的应用[5]。Etest药敏试验方法是改良的琼脂扩散法，又称为浓度梯度法，是使用预先制备的含梯度抗生素药物浓度的试纸条，贴在已涂布真菌的平板后，经过一段时间孵育，根据抑菌环大小可以读出相应药物的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration，MIC)值。目前国内针对唑类药物Etest药敏方法评价数据较少，因此本试验将以微量肉汤稀释法作为标准，评价研究Etest法检测常见念珠菌氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的准确性。

1材料与方法

1.1 菌株来源 测试5种念珠菌均来源于侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)，其中白念珠菌80株，热带念珠菌40株，光滑念珠菌40株，近平滑念珠菌40株和克柔念珠菌20株。质控菌株包括ATCC22019近平滑念珠菌，ATCC90028白念珠菌和ATCC6528克柔念珠菌。

1.3 方法

1.3.1 微量肉汤稀释法：微量肉汤稀释法操作严格按CLSI M27文件操作[5]。抗真菌药物检测浓度范围：氟康唑0.125～64 μg/ml，伏立康唑0.03～16 μg/ml，伊曲康唑0.03～16 μg/ml。35°C孵育24 h后读取药敏结果。

1.3.2 Etest方法：检测方法主要参考厂家说明。用生理盐水制成0.5 MCF浓度的菌悬液；用无菌拭子沾菌液后挤干，轻轻在RPM1640琼脂表面均匀密涂；将Etest条贴在琼脂表面；35°C孵育24 h后读取药敏结果。抗真菌药物检测浓度范围：氟康唑0.016～256 μg/ml，伏立康唑0.002～32 μg/ml，伊曲康唑0.002～32 μg/ml。

1.3.3 药敏结果判定：根据CLSI M60[6]对氟康唑和伏立康唑的敏感性进行判定。对于白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌，氟康唑：敏感(susceptible，S)≤2 μg/ml；剂量依赖性敏感(susceptible-dose dependent，SDD)4 μg/ml；耐药(resistant，R)≥8 μg/ml；伏立康唑：S≤0.12 μg/ml；中介(intermediate，I)0.25～0.5 μg/ml；R≥1 μg/ml。光滑念珠菌，氟康唑：SDD≤32 μg/ml，R≥64 μg/ml；伏立康唑无折点。克柔念珠菌，无氟康唑折点；伏立康唑：S≤0.5 μg/ml，I 1 μg/ml，R≥2 μg/ml。

CLSI M60[6]未规定伊曲康唑的临床折点，本研究参考CLSI M59[7]文件中伊曲康唑的流行病学折点(epidemiological cutoff value，ECV)对菌株界定为野生株(wide-type，WT)或非野生株(non-wide-type，NWT)。光滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌的伊曲康唑ECV分别为4，1和0.5 μg/ml。

1.3.4 结果比较：分别统计两种方法的基本一致率(essential agreement，EA)和分类一致率(categorical agreement，CA)。EA指的是Etest方法和微量肉汤稀释法的MIC值相差在2个梯度以内。CA指的是Etest方法和微量肉汤稀释法的判定结果一致(均为敏感、中介或耐药)的菌株占总测定株数的比率。显著错误(very major error，VME)，即微量肉汤稀释法为耐药，Etest方法测试为敏感；大错误(major error，ME)，即微量肉汤稀释法为敏感，Etest方法测试为耐药；小错误(minor error，MiE)，即其中一种方法为中介(I)或剂量依赖性敏感(SDD)，另外一种方法测试结果为敏感(S)或耐药(R)。

2结果

2.1 Etest方法和微量肉汤稀释法检测念珠菌唑类药物敏感性的基本一致率(EA) 见表1。

表1 Etest方法和微量肉汤稀释法检测念珠菌唑类药物敏感性的基本一致率(EA)

注：BMD，微量肉汤稀释法；EA，基本一致率。

分别计算两种检测方法的氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑MIC50和MIC90，除伊曲康唑MIC90相差大于1个梯度，其余唑类药物MIC50与MIC90相差均在1个梯度内。对于氟康唑有7株菌两种方法MIC值相差2个梯度以上，其中5株近平滑念珠菌的Etest结果低于微量肉汤稀释法2个梯度以上。对于伏立康唑有6株菌两种方法MIC值相差2个梯度以上，其中4株白念珠菌Etest结果低于微量肉汤稀释法2个梯度以上。对于伊曲康唑有40株菌两种方法MIC值相差2个梯度以上，其中13株热带念珠菌和11株近平滑念珠菌Etest结果低于微量肉汤稀释法2个梯度以上，9株光滑念珠菌Etest结果高于微量肉汤稀释法2个梯度以上。

2.2 Etest方法和微量肉汤稀释法检测念珠菌唑类药物敏感性的分类一致率(CA) 见表2。对于氟康唑，白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌中两种检测方法的CA一致率均超过90%，Etest检测错误类型均为小错误。对于伏立康唑，白念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌中两种检测方法的CA一致率均大于95%，无显著错误和大错误；而热带念珠菌两种方法CA一致率低于90%，其中3株中介株Etest检测为敏感，4株耐药株Etest检测为中介。对于伊曲康唑基于ECV评价两种检测方法一致率，光滑念珠菌一致率仅为70%，有12株光滑念珠菌野生株Etest检测为非野生株。

表2 Etest方法和微量肉汤稀释法检测念珠菌唑类药物敏感性的分类一致率(CA)

注：BMD.微量肉汤稀释法；S.敏感；SDD.剂量依赖敏感；I.中介；WT.野生型；NWT.非野生型；CA.分类一致率；VME.显著错误；MER.大错误；MiE.错误。

3讨论目前真菌体外药物敏感性试验常用方法包括微量肉汤稀释法，ATB Fungus 3，Sensititre YeastOne药敏板、CLSI纸片扩散法、丹麦ROSCO纸片扩散法和Etest方法。CLSI微量肉汤稀释法是目前认可的金标准方法，但是操作比较复杂，耗时耗力，结果不易判读[5]。ATB Fungus 3和Sensititre YeastOne药敏板为商品化改良微量肉汤稀释法。CLSI纸片扩散法和丹麦ROSCO纸片扩散法，纸片不同但检测原理相似，即通过药敏纸片抑菌环直径大小判断菌株对不同药物的敏感性，操作相对简便，但不能直接测得最小抑菌浓度[8]。Etest方法则是将琼脂扩散法与MIC检测相结合的方法，即将已包被不同药物浓度的药敏条贴在涂布了菌液的琼脂平板上，孵育一定时间后能够根据抑菌环大小直接读取MIC值，因此Etest方法结合了纸片扩散法操作方便、结果易读取及可直接获得MIC值的优势。既往有研究评估唑类药物Etest法与微量肉汤稀释法一致率，但不同研究结果存在差异[9-12]。在PFALLER等[9]评估的1 568株念珠菌研究中，结果显示对于氟康唑，Etest法与CLSI微量肉汤稀释法EA为96.4%，对于伏立康唑两者的EA为98.1%，与本研究对比结果接近。也有研究比较欧洲EUCAST肉汤稀释法与Etest法的一致率，发现伏立康唑一致率最高为86.6%，氟康唑86.6%，伊曲康唑最低70.7%[10]，与本研究结果相符但总体一致率偏低。本研究两种方法检测氟康唑和伏立康唑的一致率较高，EA和CA均超过90%，但两种检测方法测得的伊曲康唑EA亦较低，主要原因是部分热带念珠菌和近平滑念珠菌Etest检测结果低于微量肉汤稀释法检测结果，而光滑念珠菌部分菌株Etest检测值高于微量肉汤稀释法，导致一致率偏低。因此对于热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌，伊曲康唑Etest结果的判读须谨慎，但因伊曲康唑并非治疗深部念珠菌感染的首选药物，因此对于临床治疗侵袭性念珠菌感染疾病影响不大[13]。另外，本研究未评估泊沙康唑，但既往有研究显示泊沙康唑Etest结果与微量肉汤稀释法的CA为93%[14]。本研究存在一定局限性，首先克柔念珠菌数量偏少，并且本研究并未覆盖其他少见菌种，因此研究结论无法代表全部念珠菌属。另外，CLSI M60仅规定了部分念珠菌对氟康唑和伏立康唑的临床折点，而伊曲康唑无临床折点，本研究主要参考CLSI M59规定的伊曲康唑流行病学折点进行分析，因此两种方法统计得出的伊曲康唑CA仅供参考。但基于本研究综合考虑，Etest法与微量肉汤稀释法检测念珠菌唑类药物敏感性一致率较高，药敏结果易于读取，是适于在临床实验室检测唑类药物敏感性的方法。