人白介素10荧光定量PCR检测方法的建立及其在糖尿病肾病中的表达研究*

岳芳芳，倪文娟，冷小敏，刘 云，师晶晶，曹东东，郭明好，马东红

(新乡医学院第一附属医院a.肾脏病医院肾脏免疫研究所；b.生命科学研究中心，河南卫辉 453100)

白介素10(interleukin-10，IL-10)是目前公认的抗炎与免疫抑制因子，它主要由Th2细胞、调节性T细胞和单核/巨噬细胞产生，在炎症疾病、自身免疫性疾病、器官移植、血液疾病及癌症中具有重要价值，参与炎性反应和免疫反应[1]。研究表明IL-10参与糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发生，其可能成为DN治疗的新靶点之一。而既往关于IL-10在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)或DN中表达水平的研究得出了相矛盾的结论[2-5]，为进一步明确IL-10在DN患者中的表达水平，我们有必要建立一种稳定、灵敏的检测方法。本研究主要从模板浓度、引物筛选两方面优化IL-10 RNA荧光定量技术，并进一步对IL-10在DN组及对照组中的表达水平进行批量对比，为DN发病机制的进一步研究奠定基础。

1材料与方法

1.1 研究对象 DN组：选取2017年8月～2018年5月于新乡医学院第一附属医院肾病科及内分泌科住院的33例DN患者，其中DNⅢ期患者11例，平均年龄58.91±10.50岁；DNⅣ期患者22例，平均年龄57.55±10.43岁。对照组：健康体检人员35例，平均年龄53.66±5.80岁。其中，DN组T2DM的诊断符合中国2型糖尿病防治指南(2017年版)[6]中T2DM的诊断标准；根据Mogensen分期，达到DNⅢ期、Ⅳ期标准。所有入组研究对象均知情同意并签署知情同意书。由新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 引物的设计与合成：根据Genbank中人IL-10，β-actin的基因序列信息，使用Primer 5.0软件设计3对引物(分别简称P1，P2，P3)。由北京六合华大基因科技有限公司合成。IL-10的荧光定量PCR扩增引物信息见表1。

表1 IL-10的荧光定量PCR扩增引物

1.3.2 血液样本处理：抽取外周静脉血3 ml置于抗凝管中，4℃保存，24 h内进行处理。

分离淋巴细胞：3ml人外周血淋巴细胞分离液加3ml的全血离心，600 g 20 min。吸取环状乳白色淋巴细胞层到另一离心管中；加入同体积的生理盐水清洗淋巴细胞，250 g离心10 min后弃上清；重复清洗2次；弃上清后得细胞，加入500 μl的RNAiso Plus裂解细胞。

1.3.3 RNA的提取及cDNA的合成：提取RNA：向上述匀浆裂解液中加入三氯甲烷(RNAiso Plus的1/5体积量)，混匀，室温静置5 min。4℃ 12 000 g离心15 min，吸取上清液至另一离心管中。向上清中加入0.5倍RNAiso Plus体积的异丙醇，混匀，室温静置10 min。4℃ 12 000 g离心10 min，弃上清，加入与RNAiso Plus等量的75%(v/v)乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁；4℃ 7 500 g离心5 min后弃上清。室温沉淀干燥5 min，沉淀干燥后，加入20 μl的RNase-free水溶解沉淀。经超微量分光光度计测定其浓度，并取2 μl进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)进行基因组DNA的去除并进行反转录反应。

1.3.4 荧光定量PCR反应条件的优化：20 μl反应体系：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μl，cDNA模板1 μl(在原液的基础上稀释不同的倍数：100，101，102，103，104)，灭菌水7 μl。程序设置：预变性95℃ 30s，变性95℃ 5s，延伸60℃ 34s，共40个循环；熔解曲线阶段95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。在反应体系基础上，使用3对不同的引物(P1，P2，P3)进行PCR扩增。

1.3.5 特异性检测：荧光定量PCR结果熔解曲线分析查看是否有特异型单峰，并进一步将荧光定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，验证扩增产物的特异性。

2结果

2.1 标准曲线 P1的相关系数为0.976 7，斜率为-2.474 6；P2的相关系数为0.782 2，斜率为-1.902 3；P3的相关系数为0.999 6，斜率为-3.272 2。在P3扩增体系下可以得到最优的标准曲线，使起始模板浓度与循环数有良好的线性关系。

2.2 扩增曲线、熔解曲线 P3的扩增曲线符合标准的“S”形荧光扩增曲线，曲线拐点清楚，基线平而无明显上扬趋势；熔解曲线呈单一的主峰，说明扩增产物特异，没有非特异性产物出现，见图1。

A：cDNA模板在100，101，102，103稀释倍数下，引物为P3时获得的扩增曲线；B：引物为P3时获得的熔解曲线。

2.3 琼脂糖凝胶电泳 应用P1，P3扩增的产物基本稳定，在cDNA模板稀释倍数为100时，条带清晰、稳定，分辨率高；电泳仅观察到一个预测大小的单条带，说明特异性扩增无明显的副产物；当cDNA模板稀释倍数为103，104时，在P1，P3未见扩增产物，见图2。

M：分子量标准 DL2000；1～5：荧光定量cDNA模板稀释倍数依次为：100，101，102，103，104；A，B，C分别为P1，P2，P3在不同cDNA模板稀释倍数下扩增的电泳成像结果。

图2 PCR产物凝胶电泳图像

2.4 DN组与对照组IL-10 RNA表达水平 将建立的实验条件用于检测两组IL-10RNA的表达，结果显示：与对照组(14.39±1.14)相比，DN组(16.21±1.84)的RNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(t=7.049，P<0.01)。考虑到DNⅢ期、DNⅣ期的临床表现不同，其IL-10RNA表达可能存在差异。因此，我们又进行了组间对比，结果显示：DNⅣ期患者的RNA水平较DNⅢ期患者稍有升高，差异无统计学意义(t=1.537，P=0.129)；但与对照组相比，DNⅢ期(16.69±1.06)与DNⅣ期(15.96±2.09)患者IL-10RNA的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(t=8.452，5.248，均P<0.01)。

3讨论以往研究表明，炎症在DN的进展中起着重要作用[7]。IL-10作为目前公认的抗炎与免疫抑制因子，在DN的发生发展过程中具有重要价值。关于在T2DM或DN中IL-10表达水平的检测，目前的研究大部分都采用ELISA法，但得出了相矛盾的研究结果[2-5]。ELISA的检测方法需要特异的抗体和一定量的蛋白，在进行抗原或抗体检测时可能会出现假阳性或假阴性，灵敏度不高[8]；对分析低水平表达的细胞因子不够敏感，且只能从单个样本中分析有限的细胞因子。而实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)技术具有操作方法简单、灵敏度高、特异度强的优点，即使是对低水平的细胞因子基因表达，也是一种有效的定量方法。近年来，qPCR被广泛用于定量细胞、体液、组织或组织活检中RNA的表达水平。该技术不仅在分子生物学的各个领域得到了充分利用，在许多疾病的诊断方面，特别是肿瘤的早期诊断、疗效观察以及癌基因与肿瘤的关系方面也有涉及[9-10]。但qPCR 对反应条件的变化相当敏感，一旦条件不合适便得不到理想的结果，所以优化反应条件是qPCR获得可靠结果的前提[11]。

本研究利用qPCR来检测IL-10RNA表达，从模板浓度、引物筛选两方面进行探索，当20 μl反应体系475 ng RNA逆转录成cDNA后取1 μl，引物为F：5’-GTGATGCCCCAAGCTGAGA-3’，R：5’-CACGGCCTTGCTCTTGTTTT-3’时，能够得到较为稳定灵敏的扩增效果。我们前期通过ELISA法对比两组IL-10表达水平，结果显示DN组IL-10表达水平明显低于对照组(P<0.01)。该结果与本实验研究结果是一致的，进一步证实IL-10是参与DN发病机制的一个重要环节，其在DN患者中表达下调。

在关于IL-10在T2DM或DN中表达水平的研究中，本研究结果与YUAN等[4-5]一致，但与AL-SHUKAILI等[2-3]相反，考虑有以下原因：与以往研究不同，在关于DN患者的研究中我们首次参考了Mogensen分期，本研究中病例组主要以DNⅢ期、Ⅳ期为研究对象。WONG等[3]的研究未对入组标本进行分期；AL-SHUKAILI等[2]的研究中其研究对象为T2DM患者，尚未发展至DN阶段。因此研究结果不一致可能与入组标准不一致、入组患者结构、年龄及病程存在差异有关。另外，本研究中DNⅢ期、Ⅳ期患者的IL-10RNA表达无统计学意义，考虑可能受样本量小的影响。综上，本研究优化的实验条件操作简单、结果稳定，利于临床推广应用；该检测方法可为DN抗炎机制的研究提供技术支持。