表面活性剂溶血能力及其在微核制片中的选择研究*

林芝源，吴圻荣，李 灏，彭彩霞

(茂名市职业病防治院，广东茂名 525011)

表面活性剂有多种功能，应用广泛。某些表面活性剂能使血液细胞发生裂解，具有溶血作用，在医学检验中常用来配制溶血剂或清洗剂[1]。国内关于表面活性剂溶血能力的研究报道较少，曾有学者用鸭血来做实验样本的溶血研究[2]，但人与动物的红细胞(RBC)有差异。微核测试是遗传毒理学检测方法，是评价辐射损伤的指标之一，微核制片过程须除去RBC，对溶血剂的选择还是一大难题，目前采用的KCl低渗溶血法[3]，其溶血时间长，溶血程度较难把握，影响结果的准确性。本文采用人外周血液为实验样本，探讨了阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、非离子表面活性剂辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100)、乳化剂辛基苯酚聚氧乙烯(10)醚(OP-10)等的溶血特性，对选择表面活性剂CTAB用于微核制片的作用机制进行了研究，为临床应用溶血试验以及提高微核制片的质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 来自职业体检的参检人员，静脉抽血，EDTA-K2抗凝，通过体检结果查询RBC各项数据，选取MCV在85～97 fl之间、Hb在120～168 g/L之间的新鲜血液。另外，选择MCV分别为：98.1，92.3，86.2，79.8，73.5，67.5和61.7 fl的血液样本7例，每例样本一分为二，其中一份作为对照组。

1.2 仪器和试剂 721分光光度计(上海精密仪器有限公司)，光学显微镜(日本OLYMPUS公司)。CTAB(山东济宁化工研究所，AR)；SDS(广州市中南化工仪器有限公司，AR)；TritonX-100(博美生物科技有限公司，进口分装，纯度>99.0%)；OP-10(天津市北联精细化工有限公司，CP)。

1.3 研究方法

1.3.1 样本处理：抗凝血液用生理盐水1∶4稀释洗涤2次(对照组除外)，按比容配制成一定浓度的RBC悬液(v/v)。

1.3.2 试剂配制：称量一定重量的表面活性剂，用热蒸馏水溶解后配制成20 g/L的原液，再用生理盐水稀释为应用液。

1.3.3 溶血试验：等渗条件下，红细胞悬液与表面活性剂溶液混合，溶血15 min，离心吸取上清液稀释一定的倍数，于540 nm波长比色，用吸光度(A)来比较溶血程度。溶血能力比较试验：50%(v/v)RBC悬液0.50 ml与2.0 g/L表面活性剂溶液0.2 ml混合，重复3次；溶血敏感度比较试验：3.0%(v/v)RBC悬液与不同浓度的表面活性剂溶液等体积混合(混合液最终浓度为原液的1/2)，观察5s～10s内完全溶血时(悬液透明)所需表面活性剂的最低浓度，重复5次；悬液RBC含量对溶血能力的影响试验：RBC悬液倍比稀释成7个梯度(50.00%，25.00%，12.50%，6.25%，3.12%，1.56%和0.78%)，分别取0.50 ml与1.0 g/L的表面活性剂溶液0.15 ml混合，重复3次；MCV大小、RBC洗涤与否对溶血能力的影响试验：7例MCV不同的样本，洗涤组和对照组(未洗涤)同时配成25% RBC悬液，分别取1.00 ml与1.0 g/L的CTAB 溶液0.20 ml混合，重复3次。

1.3.4 白细胞形态改变的观察与判断标准：取浓度分别为0.1，0.5和1.0 g/L的CTAB溶液与3%(v/v)RBC悬液等体积混合(混合液最终浓度为原液的1/2)，完全溶血后(约10 s)用显微镜观察白细胞形态的变化，重复5次。判断标准：白细胞形态完整，胞膜圆滑(-)；出现胞浆膨出或胞膜陷入的细胞(±)；胞浆膨出或胞膜陷入的细胞占20%以上(+)；见到胞浆消失的裸核(++)；裸核占20%以上(+++)。

1.4 统计学分析 利用SPSS16.0软件进行统计学分析，两组间比较采用非参数秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 溶血能力比较 4种表面活性剂CTAB，SDS，TritonX-100和OP-10的溶血结果(相对A值)分别为：0.635，0.382，0.205和0.198，溶血能力强弱依次为：CTAB>SDS>TritonX-100>OP-10。

2.2 溶血敏感度比较 10 s内完全溶解1.5%(v/v)RBC悬液时，混合液所需各种表面活性剂的最低浓度分别为CTAB：0.05 g/L，SDS：0.08 g/L，TritonX-100：0.14 g/L和OP-10：0.15 g/L。

2.3 RBC含量对溶血能力的影响 结果见表1。RBC浓度由低到高，4种表面活性剂的吸光度(相对A值)在一定范围内与RBC浓度呈正比，当溶血不完全时，随着RBC含量的增加而降低，溶血程度曲线表现为两边低中间高的峰形。

表1 RBC含量对溶血能力的影响(相对A值)(n=3)

2.4 MCV大小、RBC洗涤对溶血能力的影响 结果见表2。对照组吸光度(相对A值)低于洗涤组，差异有统计学意义(Z=-2.366，P=0.018)；两组的吸光度(A值)都随着MCV的减小而降低。

表2 MCV大小、RBC洗涤对溶血能力的影响(相对A值)(n=3)

2.5 CTAB对白细胞形态的影响 结果见表3。在0.05 g/L CTAB混合液中，RBC溶解后白细胞(粒细胞和淋巴细胞)胞浆仍保持完整，60 s出现胞浆膨出或胞膜陷入的不规则形状，300 s后或CTAB浓度增大时，可见到胞浆消失的裸核。

表3 CTAB对白细胞形态的影响(n=5)

3 讨论

3.1 目前，表面活性剂溶血机理尚未清楚，一般认为是表面活性剂对细胞膜上的脂类有特殊作用，能使细胞膜发生变化，低浓度时可改变细胞膜的结构，提高细胞膜的渗透性，使细胞吸水后膨胀破裂而导致溶血；当浓度高达一定范围时，表面活性剂在细胞膜上达到饱和，使细胞膜发生溶解导致溶血[4]。另一方面，细胞膜表面的脂蛋白对表面活性剂有淬灭作用，膜表面的脂蛋白越多，表面活性剂对细胞膜的破坏作用越弱[5]。

本课题用人外周血液探讨了各种表面活性剂的溶血特性，研究发现，阳离子表面活性剂CTAB的溶血能力最强，这与文献[2]报道的TritonX-100溶血能力最强、SDS溶血能力大于CTAB的结果不相符，这是否为试验方法或是试验材料的差异，有待以后深入研究。本研究结果显示，当溶解液中RBC过剩时，溶血程度随着RBC含量的增加而降低，可能是红细胞膜表面的脂蛋白对表面活性剂有淬灭作用，出现抗溶血作用的缘故，因为RBC含量越多，膜表面积越大，脂蛋白含量越多。此外，本研究结果还显示，RBC浓度(v/v)一定时，溶血程度随着MCV的减小而降低，也可能与红细胞膜表面积比例增大有关，因为相同比容的悬液，RBC体积越小，其含细胞数越多，膜表面积也越大。这些研究结果提示红细胞膜对表面活性剂有一定的抗溶血作用，一定浓度的混合液红细胞膜表面积越大，溶血程度越低。另外，本研究结果还显示，未洗涤RBC悬液其溶血程度低于洗涤组(P<0.02)，可能是未洗涤RBC悬液含有较多的血浆，血浆中的脂质或蛋白质等成分消耗了部分表面活性剂的缘故。这表明血浆对表面活性剂有一定的降溶血作用。

本实验表3结果显示，在0.05 g/L CTAB溶解液中，红细胞溶解后，白细胞胞浆仍保持一定的时间，最后才变为裸核。这表明，在低浓度的CTAB溶解液中，CTAB对红细胞膜的破坏作用较白细胞强。

3.2 微核制片过程的主要步骤是除去红细胞，获得足够数量的淋巴细胞，如何去除红细胞而又保证淋巴细胞的完整是微核制片的关健[6]，因此，微核制片所用的溶血剂必须具有对红细胞的破坏作用较淋巴细胞强、或者选择性地破坏红细胞的功能。本研究结果表明，低浓度的CTAB溶液具有对红细胞的破坏作用较淋巴细胞强的特性，适用于微核制片。这是由于红细胞膜与淋巴细胞膜的结构和成份比例有差异[7]，对表面活性剂的敏感性不同，可以作如下解释：①红细胞表面带负电荷，易与阳离子表面活性剂CTAB通过静电作用吸附于其表面[8]，加速其溶解过程。②低浓度的表面活性剂能改变细胞膜的渗透性，使细胞吸水膨胀，而红细胞膜结构简单，对膨胀的耐受能力较差，易破裂。③脂蛋白对表面活性剂有淬灭作用，在各种细胞中，红细胞膜表面含脂蛋白最少[5]，在同一溶解液中比其他细胞先溶解。④随着RBC的溶解，CTAB本身被消耗，使其在溶液中的游离浓度逐渐降低，随后减弱了溶解液对淋巴细胞的破坏作用。因此，在合适的CTAB浓度和一定的溶血时间内，能使红细胞完全溶解，而淋巴细胞维持原有体积状态，然后经固定剂固定，使胞浆得以保留[9]。可见，用表面活性剂CTAB溶血除去红细胞，与常规低渗法相比较，更容易获得胞浆完整的淋巴细胞。

综上所述，表面活性剂溶血能力与RBC含量、MCV大小、RBC洗涤与否等有关，阳离子表面活性剂CTAB的溶血能力最强，对红细胞的破坏作用较各种白细胞强，是分离血液淋巴细胞的较理想溶血剂，但是，如果浓度过高或溶血时间过长，超出了其承受的限度，细胞膜也会受损甚至成为裸核，因此，掌握表面活性剂的溶血特性，调试合适的浓度比例和溶血时间，是获得高质量微核制片的关键。