改良联合酶消化法提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞

陈洪群，郑梅，晏乘曦，黄鹏，赵兴山

(1民航总医院，北京100123；2北京积水潭医院；3首都医科大学宣武医院)

随着现代动物实验技术的发展，原代细胞的分离提取已经广泛应用于各个领域的研究[1～4]。成年小鼠的心脏成纤维细胞，在研究心脏纤维化[5～7]、心衰、心脏重构[8～10]等方面应用广泛。目前大多数实验采用细胞系作为实验对象，但细胞系是永生化的细胞，其基因型、生理特性等都已发生变化，不能完全反映细胞真实状态[11]。国内偶有原代小鼠心脏成纤维细胞的提取方法，但大多是乳鼠。既往提取小鼠心脏成纤维细胞的方法多为联合酶室温下消化法[12]或利用提取心肌细胞后剩余残液培养成纤维细胞。联合酶室温下消化法受室内温度影响较大，在不同季节、不同实验室难以重复；消化提取时间过长，大量成纤维细胞被消化酶损伤，导致成纤维细胞产量少，难以传代。利用提取心肌细胞后剩余残液培养成纤维细胞法提取残液中混杂内皮细胞等导致成纤维细胞纯度低。2017年12月～2018年4月，我们在联合酶消化法的基础上改进了消化温度、提取液储存方式(改良联合酶消化法)稳定地提取了成年小鼠原代心脏成纤维细胞。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂 C57BL/6 小鼠，雌雄不限，SPF 级，42～46日龄，体质量15～20 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。主要试剂：HG/DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素均为美国 Gibco公司产品，Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶均为美国Sigma公司产品。HE染色试剂盒为北京索莱宝公司产品，盘状结构域受体 2(DDR2)一抗(ab203128)、荧光二抗(ab150080)，波形蛋白一抗(ab92547)、荧光二抗(ab150077)为美国Abcam 公司产品。

1.2 试剂准备 液体配制：10% FBS 100 mL，分别装在2个50 mL离心管里(依次加入500 μL双抗，5 mL FBS，44.5 mL DMEM)；消化酶：40 mg 胰酶、24 mg Ⅱ 型胶原酶溶于40 mL PBS中(在50 mL离心管中配制)，颠倒混匀之后，用50 mL注射器+一次性滤器过滤到新的50 mL离心管中，封口膜封口放入37 ℃水浴待用。将配好的10% FBS加入15 mL离心管中(每管加6 mL，共加10管)，加完封口膜封口放入冰盒待用。将冰冷的PBS加入100 mL的培养皿中(每皿加 20 mL，三个皿都加)，放在操作台待用。

1.3 心脏的获取 6只C57 BL/6成年小鼠拉颈处死后，放在含75%酒精的容器中浸泡5 s取出，固定在泡沫板上，固定四肢，依次剪开皮肤、剪开胸骨剑突，暴露心脏，用另一个镊子在主动脉根部薅下心脏，立即放入含有冰冷PBS的100 mL皿里。清洗心脏，洗净血污，修剪结缔组织和心房，保留心室(在3个皿中洗净血污)。用镊子将心室块加入50 mL离心管中，用弯头剪剪碎，大约 1 mm3方块。

1.4 改良联合酶消化法提取心脏成纤维细胞 消化：向含有心室碎块的50 mL离心管中加入预热好的消化酶 5 mL，封口后，置于37 ℃温育，轻摇6 min，静置10 s，用3 nL塑料吸管吸取上清，加到含有10% FBS的15 mL离心管中，轻轻颠倒混匀几次，拧紧盖子，封口，放入冰盒。剩余心室碎块，继续加入5 mL 消化液，重复上述消化步骤，直至将组织消化(大约消化 10 次)。所得细胞悬液拿进操作台，用70 μm细胞筛过滤到50 mL离心管中，每个50 mL离心管中装30 mL。 离心：将装有细胞悬液的50 mL离心管配平后，1 200 r/min离心7 min。取出后，弃掉上清，用10% FBS轻轻吹打混匀细胞，接种到T25培养瓶中,放入温箱培养。差速贴壁：2 h后，取出T25培养瓶，吸出上清弃掉，用3 mL移液管加5 mL 10% FBS至瓶底，然后轻轻放平培养瓶，做好标记，放入温箱。隔天换液一次。传代：3 d后，待细胞长至80%～90%时，使用0.25%胰酶(含EDTA)消化细胞：将分装的胰酶放入37 ℃水浴箱待用，取出长满细胞的T25培养瓶，吸弃培养基，加入2 mL胰酶，室温下消化3～5 min，边消化边振荡，显微镜下观察细胞开始脱落时，加入培养基终止消化，反复吹打后将细胞悬液吸入50 mL离心管，以1 200 r/min 离心5 min，弃上清，使用培养基混匀细胞沉淀，种植于新的T25培养瓶，继续培养。

1.5 心脏成纤维细胞鉴定 ①苏木精-伊红染色:爬片准备：培养的心脏成纤维细胞按 1×105/孔接种于6孔板(孔中提前放入玻片)，待细胞生长至90%时，吸弃培养基，1×PBS洗3次，每次5 min。细胞固定：往爬片上加入4%多聚甲醛2 mL，盖过爬片即可，固定20 min，之后1×PBS洗3次，每次5 min染核：加入苏木素溶液2 mL，室温下染核8 min。吸弃苏木素溶液，自来水洗涤爬片，注意轻柔，避免大量细胞被洗掉。洗完之后不需分化。染胞质：加入伊红溶液，室温下染色1 min。吸弃伊红溶液，自来水洗涤爬片。封片：爬片室温下自然晾干后，中性树胶封片。此步骤必须避免气泡。 镜下观察拍照。②免疫荧光法:6孔板里的细胞长到90%,吸弃培养基，PBS轻轻洗2次，每次1 min。每孔加入4%多聚甲醛2 mL，室温下放置30 min(固定细胞)，之后吸弃多聚甲醛后用PBS洗3次，每次5 min。每孔加入0.3% Triton-X100 2 mL，室温下30 min(细胞打孔)，之后PBS洗3次，每次5 min。5% BSA封闭液，每孔1 mL，室温下封闭30 min，吸弃BSA，用滤纸吸掉多余BSA。滴加200 μL 1∶00稀释的一抗，锡箔纸严密包裹，4 ℃过夜。之后PBS洗3次，每次5 min。滴加200 μL 1∶100 的荧光标记二抗，37 ℃避光温育20 min。之后吸弃二抗，取出玻片，室温尽快晾干后用含 DAPI 的封片剂封片：此步骤不可有气泡，荧光显微镜下观察。

2 结果

显微镜下可见大量细胞贴壁，细胞呈椭圆形或圆形，立体感较强(见图1)，24 h后细胞伸展呈梭形，贴壁生长，排列紧密，细胞之间连接紧密，较扁平(见图2)。3 d后细胞平铺长满，呈梭形，细胞间排列紧密(见图3)。

经苏木精-伊红染色染色后，显微镜下观察，见细胞呈梭形，单层排列，细胞质红染，细胞核蓝染。免疫荧光鉴定可见细胞阳性表达波形蛋白(图4)和DDR2(图5)，阳性表达率可达90%以上。

图1 显微镜下原代心脏成纤维细胞形态(100×)

图2 显微镜下首次传代24 h后心脏成纤维细胞形态(100×)

图3 显微镜下首次传代3 d后心脏成纤维细胞形态(100×)

图4 波形蛋白阳性心脏成纤维细胞(免疫荧光法,400×)

图5 DDR2阳性心脏成纤维细胞(免疫荧光法,400×)

3 讨论

心肌成纤维细胞是心脏非心肌细胞的主要组成部分，占正常心脏组织细胞总数的 60%～70%，其功能主要是合成细胞外基质蛋白，是合成心肌胶原的主要细胞。正常情况下，心肌成纤维细胞数量较少且基本处于非活化状态;在缺血、压力负荷、炎症等多种病理性条件的刺激下，成纤维细胞活化，发生增殖、迁移、转化、合成细胞外基质等功能改变。心肌成纤维细胞的活化是心肌纤维化的关键步骤,其在心室重构的发展中起着非常重要的作用[13]。心肌成纤维细胞在转化生长因子β(TGF-β)刺激下，增殖分化为肌纤维细胞后，迁移、增殖及分化胶原的能力增强，同时肌纤维细胞特征性标物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达增加。激活的肌纤维细胞可产生Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维，增加细胞外基质的聚集及炎症介质的产生，造成心室重构[9,10]。

联合酶消化法是利用胰酶和Ⅱ型胶原酶对原代组织进行消化，获取相应原代细胞的方法，此方法广泛应用于犬心房肌细胞[14]、新生大鼠心肌细胞[15]、成年小鼠心脏成纤维细胞[12]等的提取。对于成年小鼠原代心脏成纤维细胞，既往多采用室温下消化，消化时间多由实验者根据实时消化情况决定，难以在多个实验室以及不同室温情况下重复。关于既往报道的37 ℃水浴消化30～40 min的消化条件，本实验组多次重复证实，此消化方法会导致大量心脏成纤维细胞破坏，无法贴壁生长或传代，于是改良了联合酶消化法，于37 ℃恒温箱内进行6 min消化，并将细胞的消化液进行冰上储存。

正常情况下心脏成纤维细胞呈梭形，HE染色可清晰显示其形态，并能观察细胞质及细胞核。在细胞形态学鉴定的前提下，进一步进行免疫荧光鉴定。波形蛋白是一种成纤维细胞标记物，是间质细胞中最主要的中间纤维，它存在于中胚层起源的细胞中[16]，并与微管、微丝共同形成了一个细胞支架网络而维持细胞完整性。实验表明，可根据抗波形蛋白表达阳性来鉴定心脏成纤维细胞。心脏成纤维细胞的一种更为特异性的标记物为DDR2[17]，是胶原特异性受体酪氨酸激酶家族的典型代表，这些受体介导细胞的生长、移行、结构形成及分化等功能，在心肌细胞及平滑肌细胞中无表达。本研究证实，改良联合酶消化法得到的细胞呈梭形，单层排列，细胞质红染，细胞核蓝染；免疫荧光鉴定可见波形蛋白，DDR阳性表达率可达90%以上，提示此法可成功地提取心脏成纤维细胞，且细胞纯度很高。

综上所述，改良联合酶消化法可以稳定地提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞， 此方法可推广应用于原代心脏细胞纤维化、心衰、心脏重构等方面的研究。联合酶消化本身对成纤维细胞有一定损害，有可能改变细胞特性，因此，更高效、无害的提取方法有待于研究者进一步探索。