原发性骨性关节炎膝关节软骨细胞差异表达circRNA、miRNA筛选和生物学功能及其相互作用分析

王莹，郭雄，王民，杨益民，任志伟，尹思

(1西安交通大学第一附属医院，西安710061；2西安交通大学医学部公共卫生学院)

原发性骨性关节炎(OA)是一种以软骨退变和继发性软骨下骨增厚、骨赘形成和滑膜炎为特征的关节疾病，是全球范围普遍存在的肌肉骨骼系统疾病，其病因复杂,涉及到遗传生物学和生物力学，发病机制至今尚不明确。公认的危险因素包括既往关节损伤、年龄、性别、遗传易感因素和机械应力因素[1]。越来越多的研究证实，miRNA作用于OA软骨细胞的靶基因，调节其表达过程，对软骨细胞代谢、增殖、分化的信号通路及细胞外基质合成与代谢产生影响。目前公开发表的与OA相关circRNA主要在ECM降解、软骨细胞增殖、细胞凋亡和炎症中发挥潜在作用，2018年Li等[2]探讨了环状RNA在骨关节炎中的潜在作用，指出 circRNAs-miRNAs-mRNAs轴在OA的发病机制中起重要作用。2018年9月～2019年3月，本研究应用生物信息学方法筛选OA膝关节软骨细胞差异表达的circRNA、miRNA，并进行功能及代谢通路分析，同时应用incromap软件对差异表达的circRNA、miRNA进行了相互作用分析，为探索OA的发病机制提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择西安交通大学第一附属医院骨科住院OA患者5例，符合Western Ontario大学和McMaster大学用OA指数(WOMAC)进行OA诊断的诊断标准，排除任何有其他骨骼或关节疾病史的患者。患者均接受膝关节置换术，术中取OA患者膝关节股骨髁软骨。另选5例肢体毁损无法保肢而接受截肢的患者作为对照，术中取膝关节股骨髁软骨。取材组织离体后立即用生理盐水冲洗，修成直径3～5 mm颗粒状，标记好每个组织标本类型及编号后置于无菌生理盐水或PBS中，12 h内做细胞培养。

1.2 OA膝关节软骨细胞差异表达circRNA筛选 根据制造商产品使用说明用TRIzol法(Invitrogen, Gaithersburg, MD, 美国)提取5例OA及正常对照膝关节软骨细胞中的总RNA，采用 NucleoSpin RNA clean-up 试剂盒(MACHEREY-NAGEL,德国)对总RNA进行纯化；使用NanoDrop ND-1000分光光度计进行总RNA定量，用甲醛变性胶电泳检测其完整性；RNA总量≥1 μg；所有软骨组织样品总RNA的A260/A280值均在1.82～2.05，样品总RNA可见清晰的28 s和18 s条带，且A260/280≥1.80；经甲醛变性胶电泳检测，RNA样品电泳条带清晰，28 s∶18 s rRNA条带亮度≥2∶1，提示样品总量、纯度及完整性符合芯片表达谱实验要求。使用Nucleospin Extract Ⅱ(MN 公司，Cat. No. 740609.250)试剂盒，按照生产商操作指导步骤对每个样本的总RNA采用随机引物扩增、然后反转录为荧光标记的cRNA；标记后的样品按照CapitalBio表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒组装好杂交仓，放在Agilent公司杂交炉中过夜杂交(16 h，20 r/min)，然后用洗脱试剂盒洗片；最后进行芯片扫描：circRNA 芯片(CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2, CapitalBio Corporation, 北京)包括170 340 个人类circRNA探针，图像采集、数据分析等由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2杂交扫描后的 tiff 格式图片数据应用Feature Extraction(v10.7) 软件进行预处理分析，将原始数据文件(.txt)导入Agilent GegeSpring软件，进行每个样品的数据归一化和质量控制分析。用Cluster3.0软件进行Cluster分析及图形化展示，进行不同组间的差异比较。以差异倍数和P值为筛选条件，筛选不同组间差异表达的circRNA，差异倍数>2及P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 OA膝关节软骨细胞差异表达miRNA筛选 将OA和正常对照膝关节软骨细胞的miRNA原始数据(下载自ArrayExpress，获取号为：E-MTAB-3514)进行对数转换后使用Quantile方法进行标准化。使用经验贝叶斯模型(eBayes),以P<0.05，差异倍数≥2或≤0.5为筛选条件，进行OA和正常对照的miRNA差异分析。应用miRror工具进行差异表达miRNA的靶基因预测，使用KOBAS软件对靶基因进行GO及KEGG富集分析。

1.4 OA膝关节软骨细胞差异表达circRNA及miRNA相互作用分析 应用miRanda 软件对差异表达的miRNA 进行miRNA-circRNA相互作用预测分析。按照P<0.05和差异倍数≥2，挑选差异倍数从大到小排列的前10个circRNA和miRNA进行相互作用分析，得到circRNA-miRNA相互作用网络。

2 结果

2.1 OA和正常对照膝关节软骨细胞差异表达的circRNA及功能、代谢通路 共筛选出1 380个表达差异的circRNA，与正常对照膝关节软骨细胞比较，OA膝关节软骨细胞上调表达的circRNA 215个，其中差异倍数5倍以上的有18个；下调表达CircRNA 1 165个，其中差异倍数5倍以上的有45个；大于60个miRNA结合位点的circRNA共有383个，其中上调表达10个，下调表达373个。符合上述条件的上调及下调表达的前10位circRNA见表1。分子功能层面，差异表达的circRNA主要影响GTP酶激活剂活性(GO:0005096)、腺苷核糖核苷酸结合(GO:0032559)、钙通道调节剂活性(GO:0005246)；细胞组成层面，主要与细胞外基质成分(GO:0044420)、带状胶原纤维(GO:0098643)、纤维状胶原蛋白三聚体(GO:0005583)；生物学过程层面，主要影响细胞成分形态发生(GO:0032989)、软骨细胞发育(GO:0002063)和肢体发育(GO:0060173)。差异表达的circRNA经KEGG 通路分析，共得出1 127条通路，按富集程度最有意义的通路与糖原生物合成(来自Biocyc数据库)、补体和凝血级联(来自KEGG路径数据库)、PDGF信号途径(来自Panther数据库)、胶原纤维组装和其他多聚体结构(来自Reactome数据库)有关。

表1 符合纳入条件的上调及下调表达的前10位circRNA

2.2 OA和正常对照膝关节软骨细胞差异表达的miRNA及功能、代谢通路 筛选出差异表达miRNA 24个，与正常对照比较，OA膝关节软骨细胞上调表达及下调表达的miRNA各12个。生物学过程层面，OA膝关节软骨细胞差异表达的miRNA主要影响含核碱基的化合物生物合成过程(GO:0034654)、细胞质翻译终止(GO:0002184)、神经生长(GO:0022008)和细胞发育(GO:0048468)；细胞组成层面，差异表达的miRNA主要与细胞内部分(GO:0044424)、翻译释放因子复合体(GO:0018444)、膜结合的细胞器(GO:0043227)、核转录抑制因子复合物(GO:0090568)相关；在生物学过程层面，差异表达的miRNA主要影响有机环状化合物结合(GO:0097159)、核酸结合(GO:0003676)和杂环化合物结合(GO:1901363)。差异表达的miRNA经KEGG通路分析，共得出470条通路，按富集程度最有意义的通路与蛋白质泛素化(来自Biocyc数据库)、白细胞跨内皮迁移(来自KEGG路径数据库)、泛素蛋白酶体途径(来自Panther数据库)、基因表达和蛋白质代谢(来自Reactome数据库)有关。

2.3 OA膝关节软骨细胞差异表达miRNA和circRNA的相互作用 与has-miR-762相关的circRNA有71个、has-miR-18a-3p相关的circRNA有25个、has-miR-136-5p相关的circRNA有5个、has-miR-3131相关的circRNA有17个、has-miR-3189-3p相关的circRNA有29个。

3 讨论

2013年国际权威期刊Nature发表了两篇有关circRNA生物学功能的论文，揭开了circRNA的神秘面纱，引起国内外学术界的广泛关注。circRNA最早于20世纪70年代在RNA病毒中发现，当时被认为是一类由外显子转录本发生错误剪接而形成的低丰度RNA分子，有学者称之为暗黑RNA。与线性RNA分子相比，circRNA呈现共价闭合环状结构，缺乏5’端腺苷帽和3’端多聚腺苷酸尾[3]，不被核酸外切酶RNase降解，所以比线性RNA更稳定，具有高度保守性。circRNA分子富含miRNA应答元件，可作为竞争性内源RNA与miRNA结合，起到miRNA海绵作用，还可以同时抑制数个不同的miRNA，发挥网络调控作用，可以通过改变miRNA应答元件的种类、数量和比例使circRNA达到不同的调节效果[4]。Zhou等[5]建立了IL-1β诱导的小鼠OA模型，应用下一代测序法筛选小鼠关节软骨环状RNA谱，并进行GO及KEGG分析预测circRNA的功能，结果表明circRNA在OA的始动和进展中起重要作用。本研究结果证实，OA与正常对照膝关节软骨细胞circRNA表达谱存在差异，差异表达基因1 380个，表明circRNA参与OA发生发展。我们针对差异表达circRNA进行GO富集分析，结果提示OA膝关节软骨细胞差异表达的circRNA主要集中在GTP酶激活剂活性、钙通道调节剂活性、细胞外基质成分、软骨细胞发育和肢体发育。KEGG通路分析得出1 127条通路，按富集程度最有意义的途径与糖原生物合成、补体和凝血级联、PDGF信号途径、胶原纤维组装和其他多聚体结构有关。

越来越多的研究证实，miRNA作用于OA软骨细胞的靶基因，参与OA的发生发展，调节其表达过程，对软骨细胞代谢、增殖、分化的信号通路及细胞外基质合成与代谢产生影响。miRNA是一类与同源mRNA相互作用的长度约22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA[6]，成熟的miRNA来自具有发卡结构的pre-miRNA，由Dicer 酶进行剪切。miRNA单链与AGO蛋白结合成RNA诱导沉默复合体并特异性地结合靶基因mRNA 的3’UTR区，通过增强降解、抑制翻译或通过其他机制来改变基因的转录后调控，从而下调miRNA的靶基因表达[7]。有前期发表的文献[7]指出，miRNA是数百个基因的调节器，这些基因与软骨发育、动态平衡和OA病理学过程有关;由于其调节凋亡和活性氧的能力，在OA软骨细胞异常自噬反应中发挥重要作用[8]。Wu等[8]对许多研究结果进行综述，发现超过25个miRNA与软骨发育和OA有关，特别是与调节软骨细胞肥大和蛋白水解酶合成相关。另外，部分OA软骨信号转导通路也受miRNA调节，例如TGF-β、骨形态发生蛋白家族、基质金属蛋白酶(MMPs)、诱导型硝酸合酶(iNOS)IL-1和TNF-α通路[9]。Cong等[10]在回顾已发表的文献时，发现许多miRNA在OA中有差异表达，其中上调的miRNA主要针对发生在细胞核的生物过程，而下调的miRNA主要针对转录过程，表明miRNA在OA的始动及发展中起重要作用。具体来讲，miR-9、miR-27、miR-34a、miR-140、miR-146a、miR-558和miR-602在OA中异常表达，在其病理过程中起重要作用。2009年，Jones等比较了接受膝关节置换的关节软骨和先前没有关节痛病史的供体死亡后捐献的软骨，用人类miRNA表达谱分析鉴定出OA患者软骨中有17个miRNA和骨骼中的30个miRNA，与正常组织相比差异倍数大于4倍。与正常对照组织比较，miR-9和miR-98在OA软骨组织中均表达上调，后期的功能研究证实miR-9和miR-98都通过抑制IL-1β介导的TNF-α产生而参与炎症途径，而miR-9的过表达也减少了IL-1β诱导的MMP-13蛋白释放[11]。Miyaki等[12]构建miR-140基因缺失小鼠诱导出OA的蛋白多糖丢失及关节软骨纤维化特征样变，证实miR-140通过靶向ADAMTS-5的基因从而抑制其表达，而ADAMTS-5是被公认重要的导致关节软骨基质降解的重要水解酶；而过表达miR-140则表现出抵抗抗原诱导性关节炎的特征。本研究应用OA和正常对照软骨的miRNA原始数据进行miRNA表达谱分析，得到差异表达基因24个，表明miRNA与OA的发生发展相关。本研究中，差异表达的miRNA的GO富集分析主要集中在含核碱基的化合物生物合成过程、神经生长和细胞发育。差异表达的miRNA经KEGG通路分析得出470条通路，按富集程度最有意义的途径与蛋白质泛素化、白细胞跨内皮迁移、泛素蛋白酶体途径、基因表达和蛋白质代谢有关。

circRNA作为miRNA海绵是比较成熟的理论，通过竞争性结合miRNA从而调控下游靶基因的翻译，二者密切相关。本研究对OA软骨进行miRNA及circRNA高通量分析，二者富集到的共同通路有Cell adhesion molecules pathway和Circadian entrainment pathway。Dudek等[13]总结了Circadian entrainment pathway在肌肉、骨骼及软骨中的作用，特别关注组织生理学中昼夜节律的证据,该领域的研究具有很大的潜力，可以帮助我们理解昼夜节律如何控制肌肉骨骼组织的正常及病理状态，对与年龄相关疾病具有重要意义，并且对运动医学有潜移默化的影响。Schett等[14]在前瞻性Bruneck队列研究中评估严重髋或膝关节OA的人口统计学特征、生活方式以及可溶性血管细胞黏附分子1(VCAM-1)的水平，得出VCAM-1可以作为严重OA具有髋膝关节置换风险强有力且独立的预测因子之结论。在一项基于手OA的患病率和严重程度相关人群的横断面研究[15]中，发现可溶性VCAM-1的血清水平与手OA的受累关节数量正相关。Karatay等[16]在关于OA治疗的临床报道中指出，关节腔注射透明质酸(HA)后ICAM-1和VCAM-1水平降低可以解释HA治疗膝关节OA的抗炎作用。

我们进而对人类OA膝关节软骨细胞circRNA及miRNA表达谱进行了整合分析，应用miRanda软件进行circRNA和miRNA相互作用分析，得到circRNA-miRNA相互作用网络。其中,has-miR-762、has-miR-18a-3p、has-miR-136-5p与 circRNA关系最为密切，结合的circRNA也最多。张申华等[17]通过qPCR分析40位卵巢癌患者癌组织中miR-762和menin蛋白的表达情况，并通过蛋白免疫印迹实验检测miR-762对menin蛋白及Wnt通路中增殖相关蛋白的调节作用，证实miR-762在人卵巢癌组织中呈高表达，并可能通过抑制menin蛋白及激活Wnt通路从而促进卵巢癌的进展。体外实验研究表明，miR-136-5p的过表达促进了脊髓损伤大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IKKβ和NF-κB的生成，抑制了A20蛋白的表达，炎性细胞向大鼠脊髓的浸润增加，导致脊髓损伤明显加重,沉默miR-136-5p可显著改善炎症细胞浸润和脊髓损伤。因此，miR-136-5p可能成为治疗脊髓损伤的新靶点。目前尚无对miR-18a-3p的报道。

差异表达的miRNA与软骨细胞自噬功能障碍、氧化应激和信号通路有关，这与OA的发病机制相关。circRNA是否也参与OA的病理生理过程被提上研究日程，circRNAs-miRNAs-mRNAs轴在OA的发病机制中起重要作用[2]，circRNA翻译而来的蛋白质在生理条件下可能相对无功能，但是细胞内或细胞外应激可能促进激活非依赖性翻译模式，因此circRNA编码的蛋白可能在病理条件下起关键作用。本研究结果与文献报道一致。目前将miRNA或者circRNA作为OA 治疗靶点的研究还局限于动物实验模型阶段，应用于临床治疗尚未取得突破性进展，真正将这类小分子应用于OA的临床治疗依然任重而道远。

综上所述，OA膝关节软骨细胞中差异表达的circRNA有1 380个，其中215个上调表达，1 165个下调表达，差异表达的circRNA主要影响GTP酶激活剂活性、腺苷核糖核苷酸结合、钙通道调节剂活性等分子功能，细胞外基质成分、带状胶原纤维、纤维状胶原蛋白三聚体等细胞组成，细胞成分形态发生、软骨细胞发育和肢体发育等生物学过程，主要与糖原生物合成、补体和凝血级联、PDGF信号途径、胶原纤维组装和其他多聚体结构等相关代谢通路有关。与正常软骨细胞比较，OA膝关节软骨细胞中共筛选出差异表达miRNA 24个，其中上调表达及下调表达的miRNA各12个，差异表达的miRNA主要参与含核碱基的化合物生物合成过程、细胞质翻译终止、神经生长和细胞发育，影响细胞内部分、翻译释放因子复合体、膜结合的细胞器、核转录抑制因子复合物，有机环状化合物结合、核酸结合和杂环化合物结合，与蛋白质泛素化、白细胞跨内皮迁移、泛素蛋白酶体途径、基因表达和蛋白质代谢有关。circRNA和miRNA共同通路有Cell adhesion molecules pathway和Circadian entrainment pathway；circRNA-miRNA相互作用网络中，has-miR-762、has-miR-18a-3p、has-miR-136-5p与circRNA关系最为密切。本研究中我们应用的CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2在每张芯片上设计了四个阵列，每个阵列包含约170 340个人类circRNA探针。即使是如此庞大的探针数量，因为芯片版本不断更新，不除外新的circRNA此次未被检测出来。进一步研究将观察内源性竞争机制影响miRNA下游靶基因的表达变化与信号通路的调控，明确miRNA,circRNA和mRNA之间的关系，探索OA中circRNA的miRNA海绵作用机制；扩大样本进行临床验证，应用OA患者的外周血验证筛选出的目标circRNA，进行诊断OA微创、快速、易得的生物标志物的探索，为进一步阐明OA的发病机制及疾病的干预靶点提供理论依据。