改良抗酸染色联合CPA在基层医院诊断肺结核中的应用价值

徐加誉，樊春卉，谭 萍

(深圳市盐田区人民医院病理科，广东 深圳 518081)

我国基层医院检验室和实验室承担着主要的肺结核疾病发现任务，但在检测肺结核疾病上存在一定局限性，以往多采用的病原学检验检验肺结核疾病，主要为MTB培养、痰涂片镜检，前者耗费检测时间，无法满足疾病诊疗需求，后者敏感性差，漏诊可能性大[1]。随着结合分支杆菌基因组学和分子生物学技术的发展，医学界建立了多种采用核酸检测技术筛查判定结核病的方式，如恒温核酸扩增、转录酶扩增(TMA)、多色荧光巢式PCR、实时荧光定量PCR等[2]。其中恒温核酸扩增技术为研讨热点，其应用前景较好。已有研究[3]明确指出，通过交叉引物恒温扩增(CPA)的检验对基层医院诊断肺结核有利。本文旨在分析改良抗酸染色联合CPA在基层医院诊断肺结核中的临床应用价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2016年5月至2019年2月深圳市盐田区人民医院收治的经临床确诊的肺结核[4]患者45例，男23例，女22例，年龄18～68岁，平均(41.5±0.5)岁。痰涂片镜检阴性标本34例，阳性标本11例。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器

Xpert MTB/RIF检测系统与试剂盒、结核分支杆菌核酸检测试剂盒、萋尼抗酸染液、普通光学显微镜、细胞涂片离心机。

1.2.2 检测方法

改良抗酸染色法：取痰液标本1 mL，根据痰液性状加入NaOH 10%(加入量为标本体积的2倍)，振荡让其液化，取标本1 mL，离心处理15 min并制片，室温下将其晾干，火焰固定后，把待检玻片放在玻璃槽内，加Triton-X100 0.2%，在4 ℃环境中放置0.5 h，将玻片取出，做冲片处理，晾干后做抗酸染色处理。

CPA检验：在实施CPA检验的过程中，须严格按照CPA检验的相关流程以及要求对其实施临床检验，避免出现错误。

CPA技术联合改良抗酸染色法，先行改良抗酸染色法检测，再行CPA检测。

Xpert MTB/RIF技术检测：取痰标本5 mL，加入到离心管内(50 mL)，再加入与标本体积相等的NaOH 2%，振荡让其液化，放置15 min，加入PBS液至45 mL，离心处理15 min，转速为3000 r·min-1，分离上清，再加入PBS洗涤液3 mL，确保pH=6.8。取经处理过的痰液标本1 mL，并将这一标本加入到已经处理后的试管中，在试管中再加入2 mL的处理液，震荡处理15 min。取处理后的样本2 mL，加入到反应盒内，并将反应盒置入检测模块内，提取核酸，并做扩增处理，检测结果。

1.2.3 观察指标

比较Xpert MTB/RIF技术、CPA技术联合改良抗酸染色法、CPA技术、改良抗酸染色法检验其痰液标本这4种方法的检验结果。

1.2.4 统计学方法

使用SPSS13.0软件分析数据，计量资料的比较采用t检验，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

痰涂片镜检阳性标本，4种检查方式阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；痰涂片涂阳标本，改良抗酸染色法阳性率为20.59%，明显低于改良抗酸法+CPA技术(58.82%)、CPA技术(47.06%)、Xpert MTB/RIF技术(55.88%)(P<0.05)。见表1。

45例标本中，改良抗酸染色法阳性率为33.33%，明显低于CPA技术联合改良抗酸染色法(62.22%)、CPA技术(53.33%)、Xpert MTB/RIF技术(64.44%)(P<0.05)。见表1。

表1 涂阳性标本和涂阴性标本4种检测方法的结果

*P<0.05，#P<0.05与其他3种方法比较。

3 讨论

肺结核指因感染结核分枝杆菌(MTB)而导致的慢性传染性疾病，对人类身体健康有严重危害。近几年来，因人口流动率大、艾滋病发病率高等因素影响，肺结核疾病发病率也日益增高，此疾病防治问题已较为严重[5]。感染结核菌者，症状多样，临床诊断难度大。实验室检查结果对临床有效诊治结核病意义重大。

以往临床应用频率较高的则为痰涂片镜检，但检出率<30%，漏检可能性大，且无法区分死菌与活菌，无法满足临床诊治的需求。痰涂片镜检经改良后则形成了传统痰涂片镜检，先处理痰液标本后，确保完全释放被包裹的结核分枝杆菌，再用玻片做离心处理，有效浓集标本内抗酸杆菌，然后做相应的破坏细胞膜处理，让菌体染色，并在染色完成后能够将其检测到[6-7]。

本研究中，传统抗酸染色镜下结核分枝杆菌密度小，需更多视野确定阳性和阴性。尤其需要注意的是，在实际的检验过程中的细菌密度较大，检测效率也较高，相比传统染色环境杂质较多的缺陷有着更多优势，采用改良抗酸染色法进行检测时，所加入的NaOH对痰液标本内蛋白成分有降解作用，避免发生假阳性、假阴性[8-9]。目前，痰涂片抗酸杆菌检验，为细菌学检测技术中最符合成本效益原则的方式[10-11]。但因分子生物学技术逐步改进，较多的分子诊断技术在结核分支杆菌检测中得到应用，CPA则为其中一种，其将核酸试纸条检测、核酸杂交、结核分支杆菌DNA扩增融为一体[12]，此方式简单快速，仅需2.5 h则可完成检验，且费用低，目测则可观察到结果，成本费用低。Xpert MTB/RIF技术属于WHO组织推出的新型分子检测方式，从目前的评估研究中来看，此方式特异性和敏感性均较高，本研究中此方式检测阳性率为64.44%，提示此方式检测涂阴性、涂阳性标本的检出率较高。现我国Xpert MTB/RIF技术仍然处于初期，检测耗材较高、仪器昂贵等对此方式的推广局限性较大。

本研究中，45例标本，改良抗酸染色法阳性率为33.33%，明显低于CPA技术联合改良抗酸染色法(62.22%)、CPA技术(53.33%)、Xpert MTB/RIF技术(64.44%)(P<0.05)。总之，Xpert MTB/RIF技术、CPA技术联合改良抗酸染色法、CPA、改良抗酸染色法检验均对临床诊治肺结核疾病有辅助性作用，且改良抗酸染色法联合CPA可代替Xpert MTB/RIF检测方式，节约检验成本，基层医院则可满足应用和推广条件。