肺腺癌患者胸腔积液EGFR、ALK、VEGF蛋白表达与性别、年龄及吸烟的关系

孙小迪，张丽媛，韩宜秀，李若葆，林涛，王柏林，黄琰

(潍坊医学院临床医学院，山东潍坊261053)

目前，恶性肿瘤居于我国居民死亡原因的第2位，仅次于心脑血管疾病，其中肺癌的发病率和病死率居所有肿瘤首位。肺癌最常见的组织病理学类型为腺癌，胸腔积液是晚期肺腺癌最常见的并发症之一。分子靶向治疗是晚期肺腺癌患者最重要的治疗手段，基因检测对于选择合理的分子靶向治疗方案非常重要。表皮生长因子受体(EGFR)、棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)间变性淋巴瘤激酶(ALK)、血管内皮生长因子(VEGF)作为肺癌最重要的驱动因子均已取得重大研究进展，但存在中小医院不能独立开展基因检测、检查费用昂贵等一系列问题[1]。对于肺腺癌合并胸腔积液患者，通过胸水细胞蜡块检测蛋白表达，可为靶向治疗选择提供更为简便的方法。基于此，本研究通过免疫组织化学方法检测肺腺癌患者胸腔积液EGFR、ALK、VEGF蛋白表达情况，探讨3种因子蛋白表达与患者临床特点的相关性，从而为肺癌的有效治疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料 筛选潍坊医学院附属医院2015年5月～2018年4月经病理确诊的肺癌患者92例，男43例、女49例，年龄42～85(61.68±8.30)岁。患者病理诊断根据2015年世界卫生组织(WHO)颁布的肺肿瘤组织学分类标准，病理分期按国际抗癌联盟(UICC)最新公布的第8版肺癌TNM分期。入组标准：①组织类型为肺腺癌；②UICC第8版肺癌TNM分期为Ⅳ期；③合并胸腔积液；④胸水细胞蜡块经HE染色查找到肿瘤细胞；⑤有完整可靠的病历资料。排除标准：①既往有其他恶性肿瘤病史；②曾接受胸腔灌注化学药物治疗；③胸水细胞蜡块经HE染色未查找到肿瘤细胞。

1.2 细胞蜡块的制作 将送检胸水样本加入保存液，静置1 h；弃去上清液，留取底部沉淀少于50 mL，摇匀。倒入50 mL离心管，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液(血性标本需加入醋酸乙醇10 mL，振荡均匀，2 000 r/min离心5 min，去除血细胞干扰)。将沉淀加入甲醛溶液5 mL，振荡，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液。加95%乙醇10 mL，振荡，2 000 r/min离心5 min(对于沉淀较少的标本，换用1.5 mL离心管，12 000 r/min高速离心)。常规取以上处理胸水样本，擦镜纸包裹，放入取材盒，快速脱水处理3 h，包埋，切片。

1.3 胸水细胞HE染色 将石蜡切片置于烘箱中76 ℃烤4 h，取出切片立即放入二甲苯Ⅰ中15 min、二甲苯Ⅱ中15 min至透明。将切片取出稍甩去二甲苯，依次放入无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min；蒸馏水冲洗3～5次，稍甩干水分后苏木素染色5～10 min，自来水冲洗3次；放入1%盐酸乙醇中5～10 s，自来水冲洗3次；放入1%氨水10～20 s，蒸馏水冲洗3次。1%伊红液染色2～3 min。依次放入70%乙醇1 min、80%乙醇1 min、95%乙醇Ⅰ2 min、95%乙醇Ⅱ2 min、无水乙醇Ⅰ3～5 min、无水乙醇Ⅱ3～5min；中性树胶封片。显微镜下筛检，92例均查见肿瘤细胞。

1.4 胸腔积液EGFR、ALK、VEGF蛋白表达检测 采用免疫组化法，所有抗体及工作液均购自福州迈新公司。将HE染色查见肿瘤细胞的蜡块制作4 μm厚切片，76 ℃烤片4 h。一抗选用EGFR、ALK、VEGF，按照一抗要求进行Eli Vision两步法染色，DAB显色，再以苏木素复染，用中性树胶封固，在显微镜下进行观察。EFGR蛋白表达判定标准：细胞质和细胞膜棕黄色显色为(+)，无棕黄色显色为(-)。ALK蛋白表达判定标准：细胞中存在很强的颗粒状胞质染色为(+)，但应排除一些已知染色因素，如肺泡巨噬细胞中浅色胞质点状着色、神经来源细胞染色、腺上皮染色、淋巴细胞浸润中一些散在的淋巴网状细胞染色；细胞内不存在强颗粒状胞质染色为(-)。VEGF蛋白表达判定标准：细胞胞质呈棕黄着色为(+)，细胞胞质未着色为(-)。染色结果均由两位病理医师共同阅片，以组织学样本诊断结果为标准。细胞蜡块IHC制片背景清晰，核结构完整，着色部位正确。

1.5 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行统计学处理。计数资料以百分比表示，EGFR、ALK、VEGF蛋白表达与性别、年龄及是否吸烟的相关性采用χ2检验或Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胸水肿瘤细胞HE染色镜下表现 肿瘤细胞核大、深染，核质比例高，细胞大小及形态(多形性)与正常细胞比较差异明显，核分裂象增多。

图1 HE染色镜下肿瘤细胞图像(400×)

2.2 胸腔积液EGFR、ALK、VEGF蛋白表达 92例晚期肺腺癌患者EGFR蛋白表达阳性44例，阳性率为47.83%；ALK蛋白表达阳性14例，阳性率为15.22%；VEGF蛋白表达阳性37例，阳性率为40.22%；其中同时存在EGFR和ALK蛋白表达阳性1例，同时存在EGFR和VEGF蛋白表达阳性4例，同时存在VEGF和ALK蛋白表达阳性2例，三种蛋白表达均为阴性患者4例。

2.3 胸腔积液EGFR、ALK、VEGF蛋白表达与患者性别、年龄及吸烟的关系 女性、不吸烟肺腺癌患者EGFR蛋白表达阳性率分别高于男性、吸烟者(P均<0.05)，不同年龄之间EGFR蛋白表达阳性率无统计学差异(P>0.05)；年龄<60岁患者ALK蛋白表达阳性率高于≥60岁患者(P<0.05)，不同性别、是否吸烟间ALK蛋白表达无统计学差异(P均>0.05)；不同性别、年龄及是否吸烟患者VEGF蛋白表达阳性率无统计学差异(P均>0.05)。3种蛋白阳性表达与肺腺癌患者性别、年龄及吸烟的关系见表1。

表1 3种蛋白阳性表达与肺腺癌患者性别、年龄及吸烟的关系

3 讨论

晚期肺腺癌合并胸腔积液患者体质较差，传统检查及治疗手段多难以耐受，精准靶向治疗已成为晚期肺腺癌的患者的首选治疗手段。EGFR、ALK、VEGF为肺腺癌发生发展的重要驱动基因，是当前晚期肺腺癌患者靶向治疗的研究热点，通过细胞蜡块结合免疫组化技术检测肺癌患者胸腔积液EGFR、ALK、VEGF蛋白表达简便易行[2]。

EGFR是一种上皮生长因子细胞增殖和信号传导受体，属于ErbB受体家族的一员。EGFR在许多实体肿瘤中存在高表达或异常表达，与肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭转移及细胞凋亡的抑制有关，是决定患者是否能够应用EGFR抑制剂治疗的先决条件[3]。本研究结果显示，晚期肺腺癌合并胸腔积液患者EGFR蛋白表达阳性率为47.83%，与Zhang等[4]结论基本一致。有研究表明[5,6]，EGFR阳性表达与患者种族、性别、是否吸烟、病理类型密切相关，且在亚洲女性、非吸烟腺癌患者中阳性表达率较高。本研究结果显示，在晚期肺腺癌合并胸腔积液患者中，女性、不吸烟患者EGFR表达阳性率高于男性、吸烟患者，差异具有统计学意义。EML4-ALK融合基因于2007年首次被Soda等[7]发现，其由EML4基因与ALK基因重排形成。细胞蜡块是晚期非小细胞肺癌(NSCLC) ALK检测的良好替代物，多个回顾性研究均证实NSCLC细胞蜡块中ALK重排发生率约为5%。研究显示，中国NSCLC患者ALK表达阳性率为3%～11%[8]。杨文丽等[9]研究显示，EML4-ALK融合基因表达更容易发生在女性、年龄≤60岁、不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者。这可能与雌激素水平有关。本研究仅对晚期肺腺癌合并胸腔积液患者进行检测，发现ALK表达阳性率为15.22%，且多发生于<60岁年轻患者，与性别、是否吸烟无关。有研究还发现，EGFR表达阴性患者中，ALK表达阳性率较高[10]。VEGF广泛分布于人体的各个器官组织中，是一种能够产生多种生物学效应的细胞因子。其与血管内皮细胞上特异性酪氨酸激酶受体结合，可促进血管生成，也是迄今发现作用最强的血管生成因子。本研究发现，在晚期肺腺癌合并胸腔积液的患者中，VEGF阳性表达率约为40.22%，且与性别、年龄、是否吸烟无关。此与叶丽新[11]报告类似。大多数研究认为，同一个患者一般不会同时发生两种或多种蛋白表达[12,13]，但是本研究有少数患者同时存在2种蛋白阳性表达，提示EGFR、ALK及VEGF蛋白表达可能存在相互联系。但是，本研究例数较少，EGFR、ALK及VEGF表达之间是否真正具有相关性还有待加大样本进行深入研究。

胸腔积液是晚期肺腺癌患者最常见的并发症之一，常导致胸闷、气促、肺不张、肺部感染等，严重影响患者的生活质量，故积极寻求合理的治疗方案对晚期肺腺癌患者至关重要。胸水细胞学检查可为合并胸腔积液肺腺癌患者查找致病基因提供便捷检测手段[14]，分子靶向治疗晚期肺腺癌患者也已取得极大进展。对于胸腔积液EGFR、ALK、VEGF蛋白表达阳性患者可行基因测序等检查，进一步行个体化分子靶向治疗。