土贝母苷甲对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖、凋亡、自噬的影响

刘付锋，张亚伟，孙远远，陈景景，宋早智，刘号峰，刘永红，赵士弟，金功圣

(1蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233000；2福建医科大学附属军区总医院；3杭州市临安区第一人民医院；4杭州市余杭区第一人民医院)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤[1]，主要治疗策略是手术和辅助化疗。由于难以设计个体化治疗，乳腺癌患者的临床管理也是一个巨大挑战，耐药性和剂量限制性毒性都可能影响治疗效果和预后。因此，迫切需要开发新的、不良反应更小的药物来改善患者的生存质量。天然药物因其低毒性和高生物活性被广泛应用于临床医学研究[2]。土贝母苷甲是从中药南蛇藤(葫芦科)块茎中分离得到的一种天然化合物。据报道其有广泛的生物学作用，包括抗炎、抗病毒、免疫抑制等[3]。越来越多的证据表明，土贝母苷甲具有显著的抗肿瘤作用，可抑制细胞增殖，阻滞细胞周期，促进人食管鳞癌(KYSE520)、绒毛膜癌(JEG-3)、肺癌(NCI-H292)及鼻咽癌(CNE-2Z)细胞自噬[4]，有望成为一种新的抗癌药物成分。然而，土贝母苷甲对人乳腺癌细胞的作用仍不清楚。因此，本研究观察了土贝母苷甲对人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖、凋亡、自噬的影响，并探讨其潜在的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要材料 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中科院上海细胞库，加入含10%胎牛血清、5%青霉素的DMEM高糖溶液，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。土贝母苷甲标准品购于大连美仑科技有限公司，纯度>98%，使用DMEM培养液溶解成100 μg/mL储存液，于-20 ℃避光保存。胎牛血清购自德国Clark公司。DMEM高糖培养液购自美国Hyclone公司。CCK-8试剂盒、Annexin v-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、Western blotting所用配胶试剂盒、蛋白测定试剂盒均购自碧云天生物科技公司。受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、自噬标志物LC3、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(Akt)B和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)一抗及羊抗兔二抗均购自美国CST公司。带荧光标记的荧光二抗为博士德公司产品。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自大连美仑生物科技公司。

1.2 土贝母苷甲对乳腺癌细胞增殖的影响观察 将含100 μg/mL土贝母苷甲的DMEM储存液稀释成5、10、15、20、25、30 μg/mL。96孔板中细胞生长密度达到80%时，进行加药处理。设置调零孔(只加培养液)、对照孔(不加药物)及5、10、15、20、25、30 μg/mL土贝母苷甲孔，每组5个复孔。待给药48 h后，弃去含土贝母苷甲的MDEM培养液。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃摇床下孵育1 h。酶标仪上检测450 nm波长下的OD值。细胞存活率=(实验孔OD值-调零孔OD值)/(对照孔OD值-调零孔OD值)×100%。

1.3 土贝母苷甲对乳腺癌细胞凋亡的影响观察

1.3.1 细胞凋亡率测算 将乳腺癌细胞接种于6孔板，当细胞生长密度达到80%时，分为对照组和5、10、20 μg/mL土贝母苷甲组。给药48 h后，消化、离心，收集6孔板中的细胞到15 mL离心管中，加入适量PBS重悬细胞2次。将重悬后的细胞移到流式管中，每管加入500 μL的结合液(Binding buffer)。充分混匀后依次加入5 μL的Annexin V-FITC及5 μL的PI染色液。在半小时内完成上机检测，Flow J软件分析并计算细胞凋亡率。

1.3.2 细胞凋亡类型分析 选取生长状态好的两瓶MDA-MB-231细胞，一瓶不进行特殊处理，另一瓶加入含有20 μg/mL土贝母苷甲的DMEM溶液，处理24 h。收集细胞，12 000 r/min离心10 min，去上清液，预冷PBS重悬细胞沉淀3次。加入1 mL的2.5%戊二醛固定液，在电子透射显微镜下观察细胞超微结构并拍照。

1.4 土贝母苷甲对乳腺癌细胞自噬、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响观察 细胞分组处理参照“1.3.1”。采用Western blotting法检测各组细胞中的自噬相关蛋白LC3、凋亡相关蛋白RIP1、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、p-Akt、P62和p-mTOR。用裂解液裂解各组细胞总蛋白；蛋白定量后行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜；RIP1、LC3、PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗4 ℃孵育过夜后加入羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；凝胶成像系统ECL成像；用Image J软件分析各组条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.5 3-MA对土贝母苷甲诱导自噬的影响观察 将乳腺癌细胞分为对照组、3-MA组、土贝母苷甲组、土贝母苷甲+3-MA组。对照组不加入药物，3-MA组加入10 mmol/L的3-MA，土贝母苷甲组加入20 μg/mL的土贝母苷甲，土贝母苷甲+3-MA组加入10 mmol/L的3-MA和20 μg/mL的土贝母苷甲。各组培养24 h后，提取细胞总蛋白，采用Western blotting法检测细胞中的LC3、p-Akt蛋白。

2 结果

2.1 土贝母苷甲对乳腺癌细胞增殖的影响 对照组及5、10、15、20、25、30 μg/mL土贝母苷甲组细胞存活率分别为100.0%±0.7%、93.7%±2.2%、88.6%±2.7%、82.3%±4.7%、64.9%±3.8%、43.4%±5.3%、23.8%±3.7%，各组细胞存活率依次下降(P均<0.01)。

2.2 土贝母苷甲对乳腺癌细胞凋亡的影响 对照组及5、10、20 μg/mL土贝母苷甲组细胞凋亡率分别为5.3%±0.7%、9.8%±1.8%、17.8%±3.4%、37.9%±3.1%，各组细胞凋亡率依次增高(P均<0.05)。透射电子显微镜下观察发现MDA-MB-231细胞内形成吞噬泡，大量单层膜构成的自噬体和自噬溶酶体显著蓄积；高尔基体和内质网等细胞器膨胀；胞质无定形，核碎断、固缩；可见内质网包围将要被吞噬的底物，随后与初级溶酶体结合形成囊泡，可见细胞膜出泡现象。

2.3 土贝母苷甲对乳腺癌细胞自噬、凋亡、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响 对照组及5、10、20 μg/mL土贝母苷甲组细胞中RIP1、LC3蛋白相对表达量依次增加(P均<0.01)，PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量依次降低(P均<0.05)。见表1。

表1 两组乳腺癌细胞中LC3、RIP1、PI3K、Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05;与5 μg/mL土贝母苷甲组相比，#P<0.05;与10 μg/mL土贝母苷甲组相比，△P<0.05。

2.4 3-MA对土贝母苷甲诱导自噬的影响 对照组、3-MA组、土贝母苷甲组、土贝母苷甲+3-MA组的LC3蛋白相对表达量分别为1.02±0.07、0.93±0.06、1.49±0.16、1.22±0.07，土贝母苷甲+3-MA组LC3蛋白表达低于土贝母苷甲组(P<0.05)；p-Akt蛋白相对表达量分别为1.04±0.02、1.65±0.09、0.68±0.14、0.84±0.11，3-MA组、土贝母苷甲+3-MA组p-Akt蛋白表达高于土贝母苷甲组(P均<0.05)。

3 讨论

自然界中存在许多具有生物活性的三萜皂苷类化合物。多项研究表明，皂甙化合物通过调节凋亡、自噬等抑制肿瘤细胞增殖、血管生成及转移[5]。皂甙化合物可靶向作用于肿瘤的多种信号通路，显示出潜在的抗肿瘤特性[6]。许多皂苷合成的化合物如柴胡、人参、三七、甘草和黄芪等已经在临床中使用，并且有极大的前景[7]。本研究将皂苷类提取物土贝母苷甲作用于人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231，发现随着土贝母苷甲作用浓度增高，乳腺癌细胞存活率下降、凋亡率增高，提示土贝母苷甲可抑制乳腺癌细胞增殖并促使其凋亡，作用呈剂量依赖性。

细胞凋亡是由抗癌化疗药物诱发的一种重要的细胞死亡过程，其特征是细胞皱缩、细胞核破裂和凋亡小体形成。RIP1是构成凋亡小体的核心成分[8]。本研究结果显示，随着土贝母苷甲作用浓度升高，凋亡关键蛋白RIP1表达增加，提示土贝母苷甲诱导了RIP1依赖性的细胞凋亡。为了分析土贝母苷甲诱导细胞凋亡的类型，本课题组进行了细胞超微结构观察，发现MDA-MB-231细胞内形成吞噬泡，大量单层膜构成的自噬体和自噬溶酶体显著蓄积，高尔基体和内质网等细胞器膨胀，胞质无定形，核碎裂、固缩，可见细胞膜出泡现象，上述结果表明土贝母苷甲诱导MDA-MB-231细胞发生了自噬。

细胞自噬又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。发生自噬的细胞内可见自噬体空泡结构，包括自噬体、自噬溶酶体、自噬体与溶酶体融合的产物。自噬体的合成、自噬底物的吞噬、自噬溶酶体成熟及溶酶体水解酶对物质降解的过程为自噬流[9]。通过这些过程，不必要的细胞质蛋白和细胞器将被清除，实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[10,11]。各种方式的自噬在生理状态下是细胞的“管家”，可维持细胞内环境稳定，促进细胞存活[12]。然而，在疾病状态下，自噬成为一把“双刃剑”，自噬过度可诱导细胞向凋亡转化，共同促进细胞死亡[13]。许多研究表明，过度激活的自噬能够促进肿瘤细胞死亡，这是自噬介导肿瘤细胞死亡的潜在机制。本研究结果显示，土贝母苷甲作用后，MDA-MB-231细胞中自噬相关蛋白LC3相对表达量显著增加，进一步表明土贝母苷甲诱导MDA-MB-231细胞死亡是通过自噬介导的。

研究[14]表明，PI3K/Akt/mTOR信号转导通路异常激活后可诱导肿瘤发生，这个过程有细胞增殖和自噬参与。PI3K/Akt信号通路的异常激活也被证实在乳腺癌的发生发展中起重要作用[15]。PI3K-Akt-mTOR通路激活可抑制细胞自噬，该途径失活则诱导自噬。Akt是PI3K-Akt信号通路中的主要介质。mTOR是PI3K-Akt通路的下游靶点[16]。多项研究表明，自噬过程受mTOR的激活负性调控[18]。自噬过程中，PI3K的活性对自噬体形成早期的成核和组装是必须的。在自噬过程中，溶酶体降解自噬体会导致P62水平降低。本研究中，土贝母苷甲处理的MDA-MB-231细胞中P62、PI3K、Akt、p-Akt、P62、p-mTOR的表达呈剂量依赖性下降，提示土贝母苷甲诱导自噬可能是通过调节PI3K/Akt/mTOR信号转导通路实现的。

自噬抑制剂3-MA可通过抑制PI3K的作用来阻断自噬[17]。3-MA同时通过增加溶酶体碱性，破坏溶酶体功能，进而抑制自噬发生。本课题组用3-MA预处理MDA-MB-231细胞以进一步明确土贝母苷甲是否诱导自噬，结果显示PI3K抑制剂3-MA显著缓解了细胞中p-Akt蛋白水平下降趋势，推测土贝母苷甲诱导自噬的机制与下调Akt活性有关。抑制PI3K-Akt-mTOR途径是土贝母苷甲诱导过度自噬的原因，也是自噬调节的经典途径。

综上所述，土贝母苷甲可抑制乳腺癌细胞增殖、促进其凋亡并诱导细胞自噬，土贝母苷甲的自噬诱导作用可能是通过调节PI3k-Akt-mTOR信号通路实现的。上述研究结论为三萜皂苷类化合物治疗恶性肿瘤的临床试验提供了理论基础。