天然与人工合成黄酮对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡、坏死的影响

李文强，孙瑞芳，谢颖光，马金娈，周素梅

(济宁市第一人民医院，山东济宁272100)

心肌细胞功能的维持需要较多的能量，缺血导致的心肌细胞缺糖、缺氧容易造成心肌细胞凋亡和坏死[1]。大量证据表明，心脏缺血再灌注后，心肌细胞的损伤更加严重，这种现象称为心肌细胞缺血再灌注损伤[2,3]。近年来，一些研究表明黄酮类物质能够保护心肌细胞对抗缺血再灌注损伤[4]。黄酮类物质是由含酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一大类化合物。槲皮黄酮是一种天然存在的黄酮类物质，广泛存在于中草药和一些蔬菜当中。β-萘黄酮是一种人工合成的黄酮类物质。黄酮类物质因其抗细胞凋亡、抗氧化及抗炎作用，近年来引起了广泛关注[5,6]。2017年6月～2018年12月，本研究观察了槲皮黄酮和β-萘黄酮对大鼠缺血再灌注心肌细胞调亡、坏死的影响，并对两种黄酮的作用进行初步比较。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 大鼠心肌细胞系H9c2购于美国标准培养中心，接种于DMEM培养基中，加入10%经无菌灭活处理过的进口胎牛血清，将培养基置于37 ℃、5% CO2条件培养箱内进行培养。

1.2 心肌细胞缺血再灌注模型制作及黄酮用法 将细胞分为黄酮1组、黄酮2组、模型组、对照组。黄酮1、2组和模型组参照文献[7,8]方法构建心肌细胞缺血再灌注模型即糖氧剥夺再恢复(OGD/R)模型：当H9c2细胞生长融合至70%～80%时，将细胞培养基换为DMEM无糖培养基，并放置于低氧培养箱中(氧浓度为0.5%)，创造细胞氧糖剥夺的环境，37 ℃条件下培养24 h；将细胞从低氧培养箱里取出，恢复正常氧浓度，同时换为DMEM正常培养基，在此环境下，继续培养24 h。黄酮1组造模前向培养基中加入5 μmol/L的槲皮黄酮，黄酮2组加入10 μmol/L的β-萘黄酮。模型组只制作模型，不添加特殊药物。对照组细胞在正常氧浓度下、DMEM正常培养基中连续培养48 h。

1.3 凋亡细胞检测 造模结束后使用Annexin V/PI对各组心肌细胞进行双染，ModFit LT软件分析，采用双激光流式细胞仪测算细胞凋亡率。

1.4 细胞中Caspase-3检测 造模结束后采用Western blotting法检测各组细胞中裂解的Caspase-3蛋白：提取细胞总蛋白，用二尖酸法对蛋白进行量化，提取的蛋白用10%～15%的SDS-PAGE分离，转移到硝基膜(EMD)微孔；用TBS-T缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭3 h，或在4 ℃冰箱里封闭过夜；将膜条按顺序放置于孵育一抗的盒子中，加入约1 mL抗Caspase；向抗体孵育盒子的加样槽中加入辣根过氧化物酶标记的抗IgG二抗，孵育2 h。釆用光密度分析仪测定胶片上条带的平均光密度(IOD)值。以目的蛋白与内参蛋白IOD值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5 细胞坏死情况观察 造模结束后收集各组细胞培养基，注入到96孔板中，然后加入乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒中的NAD+/INT/diaphorase配制成的混合液，在室温下孵育30 min，最后用酶标仪检测96孔板中490 nm波长处的吸光度值表示LDH水平。以培养基中LDH水平反映细胞坏死情况。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率比较 黄酮1组、黄酮2组、模型组、对照组细胞凋亡率分别为11.02%±1.13%、12.75%±1.35%、23.49%±2.14%、9.38%±0.56%。黄酮1组、黄酮2组、模型组细胞凋亡率均高于对照组，黄酮1、2组细胞凋亡率低于模型组(P均<0.05)。两个黄酮组差异无统计学意义。见图1。

注：1为对照组；2为模型组；3为黄酮1组；4为黄酮2组。

图1 各组细胞凋亡情况

2.2 各组细胞中裂解的Caspase-3表达比较 黄酮1组、黄酮2组、模型组、对照组细胞中裂解的Caspase-3相对表达量分别为0.062±0.017、0.066±0.016、0.126±0.03、0.057±0.015。黄酮1组、黄酮2组、模型组细胞中裂解的Caspase-3相对表达量均高于对照组，黄酮1、2组细胞中裂解的Caspase-3相对表达量低于模型组(P均<0.05)。两个黄酮组差异无统计学意义。见图2。

注：1为对照组；2为模型组；3为黄酮1组；4为黄酮2组。

图2 各组细胞中裂解的Caspase-3表达

2.3 各组细胞培养基中LDH水平比较 黄酮1组、黄酮2组、模型组、对照组细胞培养基中LDH水平分别为(1.82±0.20)、(2.02±0.22)、(7.49±0.54)、(1.24±0.16)μU/mL。黄酮1组、黄酮2组、模型组细胞培养基中LDH水平高于对照组，黄酮1、2组细胞培养基中LDH水平低于模型组(P均<0.05)。两个黄酮组差异无统计学意义。

3 讨论

天然黄酮类化合物虽然广泛存在于自然界中，但因其结构复杂、水溶性差、生物利用度不高、不易提炼等特点限制了其广泛应用。因此，以黄酮类化合物为基础，对其进行结构改造和优化，引入具有不同作用的功能基团，以期研发一批具有更强药理作用的黄酮类新药，是该研究领域的一个重要课题。

近年来，黄酮类化合物因其抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用而备受关注。研究发现天然槲皮黄酮能够抑制缺血再灌注导致的自由基产生，进而抑制缺血再灌注导致的心肌细胞损伤。也有证据表明，人工合成β-萘黄酮通过激活抗氧化酶发挥抗氧化作用，从而防止心肌细胞损伤[9]。目前对于槲皮黄酮在抗氧化、抗凋亡和保护心肌细胞方面的研究较多，而对于β-萘黄酮抗氧化、抗凋亡方面的研究较少。本研究选取天然槲皮黄酮和人工合成β-萘黄酮，探讨两者对缺血再灌注心肌细胞的保护作用，并对两者保护心肌的作用进行初步比较，为将来药物开发和临床应用提供理论依据。研究显示，5 μmol/L槲皮黄酮、10 μmol/L β-萘黄酮与其各自更高的浓度相比，抗氧化和抗凋亡能力无明显差异[10]。故本研究中选择5 μmol/L的槲皮黄酮和10 μmol/L的β-萘黄酮进行实验。

缺血再灌注后的心肌细胞受到更加严重的损伤，大量的心肌细胞发生凋亡，甚至坏死。本研究发现，在缺血再灌注的心肌细胞凋亡率明显增加，这也说明缺血再灌注对心肌细胞造成严重损伤，诱导了细胞凋亡。导致这种现象产生的原因是心肌细胞在缺血再灌注后，细胞中产生了大量的自由基，氧化应激增强，导致心肌细胞结构与功能破坏[11,12]；自由基还能激活细胞内多种细胞凋亡信号分子，最终能够激活Caspase-3，导致心肌细胞凋亡[13,14]。本研究中黄酮1、2组细胞凋亡率低于模型组，提示黄酮可通过减少细胞凋亡从而减轻心肌细胞的缺血再灌注损伤。

Caspase-3在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，它是细胞凋亡过程中的关键执行分子，细胞内多种凋亡信号最后均通过激活Caspase-3，由Caspase-3行使细胞凋亡功能[15]。正常情况下Caspase-3以酶原的形式存在于胞质中，当凋亡信号激活Caspase-3，它被分解为两个大亚基和两个小亚基，从而使Caspase-3活化。因此检测细胞中裂解的Caspase-3可以反映细胞中Caspase-3活化情况，进而了解细胞是否开始凋亡[16]。本研究结果显示，缺血再灌注的心肌细胞中裂解的Caspase-3表达水平明显升高，而给予5 μmol/L槲皮黄酮或10 μmol/L β-萘黄酮干预后裂解的Caspase-3蛋白表达水平降低，同时减少了细胞凋亡，与相关研究[17，18]结果一致，提示槲皮黄酮或β-萘黄酮的抗凋亡机制可能与调节Caspase-3表达有关。

LDH存在于活细胞内，而细胞坏死会造成细胞膜结构破坏，导致细胞质内的LDH释放到培养液里。因此，LDH被看做细胞膜完整性的重要指标，测定培养基中LDH浓度可以用来评估细胞的坏死情况[19]。本实验结果显示，缺血再灌注心肌细胞培养基中LDH水平显著上升，这表明心肌细胞坏死显著增加。加入5 μmol/L槲皮黄酮或10 μmol/L β-萘黄酮干预后培养基中LDH水平降低，提示槲皮黄酮和β-萘黄酮均能抑制OGD/R诱导的心肌细胞坏死。

结合上述研究结果，我们认为，槲皮黄酮和β-萘黄酮均可减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡和坏死。本研究中，黄酮1组与黄酮2组细胞凋亡率、细胞中裂解的Caspase-3相对表达量及细胞培养基中LDH水平差异均无统计学意义。这表明在保护心肌细胞方面，人工合成的β-萘黄酮与天然的槲皮黄酮作用相仿。笔者认为这可能与两药的浓度选择有关，也可能β-萘黄酮的药理作用优势并不在抑制细胞凋亡和减轻细胞坏死方面。在下一步的实验中，我们将对黄酮类化合物的作用机制和剂量进一步探讨。