MMP-2基因启动子区1306位点C/T多态性与河南汉族急性缺血性脑卒中的关系

张玉超，李艾帆，李永芳，袁树华，郑红，贺颖

(1郑州市第一人民医院，郑州450000；2郑州大学基础医学院)

随着人口老龄化加速，卒中的危害也日益突出。急性缺血性脑卒中(AIS)占脑卒中的45.5%～75.9%，且发病率呈逐年上升趋势[1，2]。由于AIS病因复杂，不同病因患者的治疗及预后也不同，因此探讨AIS病因及发病机制有着重要意义。动脉粥样硬化是AIS的病理基础，而动脉粥样硬化斑块不稳定性是引发AIS的重要病因[3]。近年来很多研究表明，基质金属蛋白酶(MMPs)参与了AIS病理过程中的炎症反应和继发性脑损伤[4，5]。MMPs是在细胞外基质降解及再塑中发挥重要作用的锌离子依赖的中性蛋白酶家族。其中MMP-2能够降解纤维帽内的胶原纤维，导致动脉粥样硬化斑块不稳定，继发脑缺血再灌注损伤等[6，7]。推测MMP-2基因启动子区1306位点存在C/T(C1306T)突变，影响MMP-2的表达，导致氧化应激反应及AIS的发生。目前国内外对MMP-2与AIS关系的研究结论尚不一致[8,9]。2016年4月～2018年6月，本研究拟在河南汉族人群中进一步探讨MMP-2基因C1306T多态性与AIS的关系，从而为AIS的精准预防提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 随机选取2016年4月～2018年6月在郑州市第一人民医院神经内科住院且确诊的AIS患者300例纳入AIS组，TOAST分型[10]大动脉粥样硬化型(LAA)240例、小动脉闭塞型(SAO)55例、不明原因型(SUE)5例；选择同期体检的健康志愿者300例为对照组，性别、年龄均与AIS组相匹配。缺血性脑卒中的诊断根据第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准。所有研究对象之间均没有血缘关系，且为河南地区汉族人。本研究通过郑州市第一人民医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。AIS组合并糖尿病和高血压比例高于对照组(P均<0.05)。AIS组、对照组的总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白、血糖水平差异均有统计学意义(P均<0.05)。

1.2 MMP-2基因C1306T多态性观察 抽取两组清晨空腹静脉血3 mL，置于EDTA-Na2抗凝管，于-20 ℃冰箱保存备用。严格按照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。PCR引物序列设计参照文献[11]，由上海生工有限公司合成。MMP-2基因启动子区1306位点上游引物为5′-TCTGGGCCATTGTCAATGTTC-3′，下游引物为5′-TGAGAGATAAGCTGTGATGGG-3′，扩增产物为196 bp。PCR反应体系为15 μL，其中模板DNA 100 ng，10×buffer 1.5 μL，dNTPs 0.3 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U、上下游引物各0.25 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 25 s，54 ℃ 25 s，72 ℃ 40 s，35个循环后，72 ℃延伸3 min。下一步进行SNaPshot多重单碱基延伸反应。MMP-2基因启动子区1306位点延伸引物序列为5′-AGACCTGAAGAGCTAAAGAGGT-3′。反应体系为6 μL，包括SNaPshot Multiplex Kit 1 μL，纯化后的多重PCR产物2 μL，延伸引物0.2 μL及ddH2O 2.8 μL。反应条件为96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 s，52 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，共进行30个循环。最后取1 μL延伸产物，加9 μL上样HIDI酶，95 ℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪测序并分型。

2 结果

2.1 两组MMP-2基因C1306T多态性分型 MMP-2基因启动子区1306位点C/T基因型分布在AIS组和对照组中处于Hardy-Weinberg平衡(P分别为0.937、0.053)，具有群体代表性。两组MMP-2基因1306位点C/T基因型分布见表1。AIS组MMP-2基因1306位点TT基因型和T等位基因频率低于对照组(P均<0.05)。在显性模式和隐性模式中，AIS组CT+TT基因型和TT基因型频率低于对照组(P均<0.05)。AIS组各亚型MMP-2基因C1306T的T等位基因频率均低于对照组(P均<0.05)。见表2。为检验SNaPshot微测序技术分型结果的准确性，从已分型的三种基因型中分别随机抽取部分样本进行测序。结果显示，SNaPshot微测序技术的基因分型结果与测序结果完全一致。

表1 两组MMP-2基因C1306T多态性分布(%)

注：与对照相组比，*P<0.05。

表2 AIS组不同亚型与对照组MMP-2基因C1306T多态性分布(%)

2.2 MMP-2基因C1306T多态性与AIS的关系 以MMP-2基因C1306T多态性、高血压、糖尿病、高脂血症、高同型半胱氨酸为自变量，以AIS是否发生作为因变量，采用Logistic回归模型进行多因素分析。结果显示高脂血症、高血压、糖尿病、MMP-2基因C1306T多态性均可增加AIS的发病风险(P均<0.05)，而高同型半胱氨酸并不增加AIS的发病风险(P>0.05)。详见表3。

表3 缺血性脑卒中危险因素的多元逐步Logistic回归分析结果

3 讨论

AIS是多个遗传因素和环境因素共同作用而导致的一种多基因疾病，基因变异也是AIS的重要发病因素之一。研究表明脑血管疾病的发生与年龄、性别、遗传因素有关，且与高血压、吸烟、糖尿病、高脂血症等有直接相关性。MMPs是一组同源的、依赖锌的中性蛋白酶家族，主要由中性粒细胞、单核细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等合成与分泌，其主要功能是降解、重塑细胞外基质，维持细胞外基质的动态平衡。近年来，MMPs在卒中后炎症反应过程中的作用受到学者普遍关注，其中对MMP-2和MMP-9的研究最多，它们特异性攻击Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤维结合蛋白，这些均为血管周围基底膜的主要成分。MMPs与动脉粥样硬化过程中的炎症反应有关，能促进炎症细胞浸润、平滑肌细胞增生和迁移、新生血管形成等[12]。MMP-2在脑缺血后再灌注损伤、出血性转化、脑水肿形成、神经元凋亡等过程中也发挥重要作用[13]。MMP-2基因定位于人类染色体16q21，相对分子量为72 kD，其启动子区存在C1306T多态性。有体外实验结果表明MMP-2基因启动子区1306位点C等位基因转录活性显著高于T等位基因[13]。

多项研究报道了MMP-2基因C1306T多态性与AIS的关系。有学者[14,15]发现，MMP-2基因C1306T基因型分布在AIS病例组和对照组间无统计学差异。李凤等[16]在初发脑梗死组、复发脑梗死组和正常健康组中进行比较，发现MMP-2 C1306T基因型和等位基因的频率分布无统计学差异。而刘旭等[17]研究表明，MMP-2基因C1306T多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的发病相关，其中CT基因型可能是动脉粥样硬化性脑梗死发病的保护因素。有学者[18]研究认为，MMP-2基因C1306T多态性增加了患小血管疾病的风险。马岩萍等[19]发现MMP-2基因多态性可增加原发性高血压患者并发颈动脉粥样硬化的风险。邵暄茗等[20]研究发现MMP-2基因C1306T多态性与动脉粥样硬化性AIS发病关系密切。

本研究在河南汉族人群中进一步探讨MMP-2基因C1306T多态性与AIS的关系，发现AIS组MMP-2基因1306位点TT基因型和T等位基因频率低于对照组；在显性模式和隐性模式中，AIS组CT+TT基因型和TT基因型频率低于对照组。AIS组中的SAO亚型MMP-2基因C1306T的T等位基因频率低于对照组。Logistic回归分析结果显示，高脂血症、高血压、糖尿病、MMP-2基因C1306T多态性均可增加AIS的发病风险。上述结果提示，携带TT基因型可降低患AIS的发病风险；相反，携带CC基因型和C等位基因可能增加患AIS的风险。我们推测，可能由于MMP-2 C1306T的C等位基因导致MMP-2基因转录水平增高，MMP-2基因表达上调，进而参与了动脉粥样硬化的细胞外基质降解、炎症细胞浸润、斑块破裂等病理过程，形成附壁血栓，血栓脱落后阻塞脑血管，从而引发AIS及卒中后继发性脑损伤。

综上所述，本研究发现MMP-2基因C1306T多态性可能与AIS的发病密切相关，携带TT基因型的个体患AIS的发病风险降低。由于AIS是由多个易感基因及环境因素共同作用的复杂疾病，而本研究样本量较小，缺乏大规模、前瞻性特点，有必要在大样本、多位点、不同地区和不同种族的人群中验证上述结论；另外还需进行mRNA和蛋白水平的深入研究，从而阐明MMP-2基因参与AIS发生的具体遗传机制，为AIS的预防和治疗提供理论依据和新的思路。