臂板蛋白3A对兔下颌骨牵张成骨术后成骨效应的影响

李梅

(山东大学第二医院，济南250033)

牵张成骨术起源于矫形外科，是一类内源性的组织工程技术，既避免了供区创伤又可使软组织同步延长，广泛应用于临床颌面骨矫形手术和骨缺损矫形手术，有创伤小、无需植骨、不发生排斥反应、面部软硬组织比例协调、避免二次手术等优点。1992年牵张成骨技术首次应用于先天下颌畸形的治疗，然而其存在治疗周期长、新生骨组织矿化水平较差等问题[1]。因此，促进牵张间隙的新骨形成及矿化、缩短牵张后的固定期成为学者们研究的方向。骨组织的新陈代谢和新生作用受到神经的支配。臂板蛋白3A是一种神经轴突导向性分子，是成骨细胞分泌的一种蛋白，具有调节成骨细胞生理活动的作用，并可直接或间接调节骨骼的新生和改建。2017年1～5月，本研究观察了臂板蛋白3A对兔下颌骨牵张成骨的成骨效应的影响，以期为提高牵张间隙内的成骨质量、缩短牵张成骨治疗周期提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物与主要器材 纯种新西兰大白兔20只，5～6月龄，体质量2～3 kg，雌雄不限，适应性饲养1周，由山东大学第二医院实验动物中心提供。钛合金内置式牵张器及钛合金螺丝，臂板蛋白3A，颌骨微动力系统，iDXA，力学测试装置。

1.2 下颌骨牵张成骨模型制作及臂板蛋白3A用法 对20只新西兰大白兔行右侧下颌骨牵张成骨术。术前实验兔禁水禁食8 h，称重并记录，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)。头取侧仰位，暴露左侧下颌部，备皮，加用2%盐酸利多卡因局部浸润麻醉，消毒，铺巾。于实验兔下颌角前方、下颌骨下缘下方1 cm暴露下颌骨，暴露颏孔及颏神经；在下切牙后方0.5～1 cm处切开下颌骨上2/3，固定牵张器使其与骨面贴合；再切开下颌骨下缘1/3，使下颌骨完全离断；充分止血后分层缝合创口，术后给予10%葡萄糖80 mL加160万单位青霉素连续静滴7 d。延迟期为6 d，于术后第7天开始牵张，牵张期连续10 d，每天10：00和20：00各牵张0.4 mm，至牵张结束时共延长8 mm。将20只兔随机分为A、B两组，每组10只。A组为空白对照，模拟常规牵张成骨术后的组织再生过程。B组于牵张期第1、5、10天在牵张间隙内注射臂板蛋白3A(500 μg/kg)。牵张过程结束后进入固定期。20只兔全部存活，均出现偏颌，1只兔牵张器螺旋杆在延迟期内埋入皮下，经二次手术后重新暴露并固定。所有牵张器均固定稳固、无松动。牵张间隙处骨组织有明显增厚，表面有软组织附着。分别于固定期第2、6周，各组随机处死5只动物，取右侧下颌骨标本，以备后续实验。

1.3 下颌骨影像学检查 获得下颌骨标本后采用X线检查(50 kV，6 mA，0.06 s)，观察下颌骨形态。所获取的图像信息通过DVD刻录保存。

1.4 牵张区骨组织观察 距牵张间隙约1 cm截取牵张区及相邻的骨组织，标本浸泡在4%的中性甲醛缓冲溶液中48 h固定，然后采用10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙4周，脱钙期间每3 d更换1次EDTA溶液。脱钙之后的组织经过冲洗、梯度乙醇脱水及石蜡包埋后，沿着下颌骨的长轴方向进行组织切片，切片厚度为4 μm，不连续切片，每个标本制作6张切片，HE染色观察。

1.5 骨小梁宽度(TNTB)、新生骨数量(NBV)测算 采用图像分析软件Image-Pro Puls6.0进行骨组织形态计量分析。6张切片每张的牵张间隙内随机选择20个新生骨小梁，在每个新生骨小梁上随机测量5处骨小梁宽度，该骨小梁的宽度为所测量5处的均值，20个新生骨小梁宽度的均值即为该张切片的TNTB。对牵张间隙内新生骨骼组织的面积进行测定，包括皮质区新生骨骨量(NBV1)和松质区新生骨骨量(NBV2)，每个标本均测量6张不连续切片，取均值。

1.6 成骨区骨密度(BMD)、骨矿物质含量(BMC)检测 使用iDXA设备，调节到高分辨率、小型动物模式。用DXA扫描暂时浸泡于去离子水的下颌骨样本，将成骨区域设定为兴趣区，扫描后得到BMD和BMC。

1.7 成骨区生物力学指标检测 使用力学测试装置对两组下颌骨成骨区进行三点弯曲实验。受力区域受到1 mm/min的连续挤压，直到断裂，绘制载荷变形曲线图，并记录成骨区最大载荷(成骨区能承受的最大力)、刚度(载荷变形曲线斜率)和总能量吸收(成骨区压缩过程中吸收的总能量)。

2 结果

2.1 下颌骨X线检查结果 去除牵张器后，仅有A组在固定期第2周处死的1只大白兔下颌骨骨断端稍有活动度，约1 mm。在固定期第2周，A组X线检查显示显著的下颌骨断开痕迹，在牵张间隙中隐约可见骨骼低密度影像学特征，骨皮质无连续性(图1A)；B组亦可见显著的切开痕迹，下颌骨上部和下部边缘的部分区域模糊显示早期骨皮质成骨特征，部分区域的骨密度与周围正常骨质接近，不易区分(图1B)。在固定期第6周，A组X线检查示骨切开断端痕迹不清晰，下颌骨下缘区域形成早期皮质骨，牵张间隙内可见明显的成骨影像(图2A)；B组骨切开断端密度与周围正常骨皮质基本一致，不易辨认，牵张间隙内新骨矿化程度较好，骨断端完全愈合，下颌骨被延长(图2B)。

注：A为A组；B为B组。

图1 牵张成骨固定期第2周时两组下颌骨本X线影像

注：A为A组；B为B组。

图2 牵张成骨固定期第6周时两组下颌骨标本X线影像

2.2 两组牵张区骨组织形态变化 固定期第2周时，A组与牵张方向相同的骨细胞被拉长，胶原纤维平行排列，可见新的较细的骨小梁结构，表面覆盖了大量的成骨细胞(图3A)；B组有少量平行排列的胶原纤维组织，新生骨小梁内可见小血管生成，部分区域可以观察到骨小梁较为粗大，且骨小梁周围分布着大量的成骨细胞(图3B)。固定期第6周时，A组沿牵引方向生有较多的新生骨组织，髓腔中可以发现圆形基质细胞，内部胶原纤维基本消失，可见骨皮质结构(图4A)；B组牵张区域内有密集的骨小梁排布，且骨小梁较粗大，可见成熟的骨皮质结构(图4B)。

注：A为A组；B为B组。

图3 牵张成骨固定期第2周时两组下颌骨牵张区骨组织形态(HE染色)

2.3 两组成骨区TNTB、NBV比较 A、B组牵张成骨固定期第6周时成骨区TNTB、NBV均高于同组第2周时，相同检测时点B组成骨区TNTB、NBV高于A组(P均<0.05)。详见表1。

注：A为A组；B为B组。

图4 牵张成骨固定期第6周时两组下颌骨牵张区骨组织形态(HE染色)表1 牵张成骨固定期第2、6周时两组成骨区TNTB、NBV比较

注：与同组第2周相比，*P<0.05；与A组同时点相比，#P<0.05。

2.4 两组成骨区BMD、BMC比较 A、B组牵张成骨固定期第6周时成骨区BMD、BMC均高于同组第2周时，B组第6周时BMD、BMC高于同期A组(P均<0.05)。详见表2。

表2 牵张成骨固定期第2、6周时两组成骨区BMD、BMC比较

注：与同组第2周相比，*P<0.05；与A组同时点相比，#P<0.05。

2.5 两组成骨区生物力学指标比较 A、B组牵张成骨固定期第6周时成骨区硬度、最大载荷、能量吸收均高于同组第2周时，且相同检测时点B组高于A组(P均<0.05)。详见表3。

表3 牵张成骨固定期第2、6周时两组成骨区生物力学指标比较

注：与同组第2周相比，*P<0.05；与A组同时点相比，#P<0.05。

3 讨论

牵张成骨技术的主要原理为：将骨切断但仍保留骨膜和周围软组织，对骨骼组织按一定方向施加适当、稳定的牵引力，激活成骨细胞的骨细胞增殖功能，使骨组织再生。牵张过程中，新骨在牵张间隙内形成并矿化，同时周围血管、神经等软组织也同步扩张。牵张成骨技术有创伤小、无需植骨、不发生排斥反应、面部软硬组织比例协调、避免二次手术等优点。然而由于多种技术尚未成熟，牵张成骨治疗耗时较长，新生骨组织可能会因牵张速度控制不好而造成矿化水平差等问题。上述两方面是限制牵张成骨技术临床推广的关键问题，需要更加深入的探索和研究。为促进牵张间隙的新骨形成及矿化、缩短牵张后的固定期，学者们不断尝试新的技术手段，包括应用脱矿骨基质、高压氧、干细胞、细胞因子等，在相关实验中取得一定效果，但均未在临床推广使用。

骨的改建包括成骨细胞介导的新骨形成和破骨细胞介导的骨矿物质吸收，同时体液的配合会加速新骨的矿化及骨小梁的重新排列。临床研究发现，健康成年人的骨骼吸收和重新生成速度达到平衡，如果这个过程失衡就会引起某些骨骼疾病的发生[2，3]。目前，大多数药物是通过靶向抑制破骨细胞的生成来降低破骨细胞的骨吸收作用，如破骨细胞分化因子抑制剂。但是，由于破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞的骨形成作用之间具有相关性，此类药物在抑制骨吸收作用的同时也可导致新骨形成减少。

臂板蛋白是由分泌型和细胞膜偶联型蛋白组成的家族，是神经轴突导向因子的原型[4]。而作为一种趋化生长因子的臂板蛋白3A，其不仅在胚胎期动物脊髓中有表达，在成年动物组织中亦有表达，可参与多种生理过程，并起到重要的调节作用[5～8]。臂板蛋白3A是目前发现的最强的轴突诱导分子，已被证实参与神经系统主要结构如脑、脊髓和周围神经的形成，成人神经系统功能的调节(如轴突再生和神经修复)。臂板蛋白3A及其受体在骨细胞、成骨细胞和破骨细胞中都有表达。研究发现，对健康成年大鼠注射臂板蛋白3A后可促进成骨细胞生成，破骨细胞数量有所减少；而对于骨骼缺损的成年鼠可使骨量增加，在去势大鼠中会导致骨吸收减少[9]。臂板蛋白3A对破骨细胞和成骨细胞起着双重作用，是一种潜在的骨病治疗药物。也有研究[10]表明，臂板蛋白3A可对促进新骨生成，同时会抑制破骨细胞的生成。有学者[11]观察缺乏臂板蛋白3A的小鼠，发现其出现骨质破坏和骨合成调节因子、成骨细胞数量减少，表现为骨和软骨发育不良、结构异常等，提示臂板蛋白3A可能通过某种机制间接调节骨的形成。破骨细胞可经核因子受体活化因子配体诱导生成，而臂板蛋白3A分泌的骨保护素(OPG)对破骨细胞分化因子的活性有抑制作用，从而抑制破骨细胞的合成。当臂板蛋白3A缺乏时，破骨细胞分化信号可促进破骨细胞分化，增加骨质的破坏吸收[12～14]。臂板蛋白3A可阻断OPG缺乏的条件性小鼠颅骨细胞中破骨细胞的形成，且缺乏臂板蛋白3A的小鼠表现明显的骨量缺乏，从而证明臂板蛋白3A能抑制破骨细胞生成[15]。

常规牵张成骨建立模型时，通常先将骨完全切断，再固定牵张器，这种方式骨断端不能完全对齐，长轴方向亦可能发生变化，不易与牵张器完全贴合，使牵张器螺旋杆旋转阻力增大，致使后期骨骼愈合时发生错位、弯曲、变形，导致建模失败。本次实验在建立牵张成骨模型时进行了创新，先用来复锯将兔下颌骨上2/3切开，确定牵张器安放位置及螺旋杆穿出皮肤的位置，使牵张器与骨壁完全贴合，打孔并用螺丝固定牵张器后，再完全截断骨骼。这样可使离断的骨骼保持原有的长轴方向，牵张成骨后，骨段只在原有的长轴方向增长，提高了手术的成功率。本研究借助X线检查、骨组织形态观察、DXA扫描、生物力学实验，旨在观察臂板蛋白3A对成骨效应的影响。结果显示，随着时间推移，两组的牵张间隙内均有新骨形成并矿化，B组成骨情况优于A组；A、B组牵张成骨固定期第6周时成骨区TNTB、NBV及成骨区硬度、最大载荷、能量吸收均高于同组第2周时，相同检测时点B组高于A组；A、B组牵张成骨固定期第6周时成骨区BMD、BMC均高于同组第2周时，B组第6周时BMD、BMC高于同期A组。上述结果提示，外源性臂板蛋白3A能够促进兔下颌骨牵张间隙的愈合，促进新骨形成，提高成骨效应，缩短治疗周期。臂板蛋白3A在临床治疗中有较好的应用前景，以上结果为颌面部畸形矫正治疗提供了新的思路。