实时荧光PCR检测非洲猪瘟病毒

李玫毅

（郑州市动物卫生监督所，河南郑州 450000）

0 引言

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒引起的猪的急性烈性传染病。其临阵症状从急性、亚急性到慢性不等，以高热、皮肤发绀、全身内脏器官广泛出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征，发病率和死亡率几乎高达100%。属于世界动物卫生组织（OIE）要求报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

非洲猪瘟自8月份在我国出现以来，国务院、农业农村部等先后出台多套防控非洲猪瘟的文件和措施。2018年12月27日，农业农村部发布了119号公告，要求在非洲猪瘟防控期间生猪屠宰厂（场）应当在驻场官方兽医组织监督下，按照生猪不同来源实施分批屠宰，每批生猪屠宰后，对暂储血液进行抽样并检测非洲猪瘟病毒。经PCR检测试剂盒或免疫学检测试纸条检测为阴性的，同批生猪产品方可上市销售。这一措施能有效避免非洲猪瘟病毒流入市场，降低病毒扩散的风险，保证百姓吃上放心肉。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

样品来源于某屠宰场待宰生猪，其1860头生猪均来自不同规模养殖场及散养户，按照生猪不同来源实施分批屠宰，每批生猪≤100头的，取一个混合血样，每批生猪＞100头的，每100头取一个混合血样，不足100头的取样时按一个混合血样计。本实验抽取的混合血样样品共计32份。

1.1.2 检测仪器及试剂

PCR仪：购自西安天隆科技有限公司。

全自动核酸提取纯化仪，核酸提取试剂盒：均购自杭州博日科技有限公司。

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒，批号：19010401，购自郑州中道生物技术有限公司。

1.2 检测方法

参照非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒说明书进行。

2 结果判定

2.1 结果有效性

2.1.1 基线和阈值设定

基线调整取6—15个循环的荧光信号，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点为原则。

2.1.2 质量控制

反应结束后，阴性对照的检测结果无特定的扩增曲线，Ct值为＞38或无；阳性对照的Ct值应≤30.0，且明显的扩增曲线。

2.1.3 样品判定

待检样品荧光信号有指数型增加，且结果显示Ct值＜35.0，报告为阳性；未检测到Ct值或Ct值＞38或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。35≤Ct≤38时，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。

2.2 结果

所有样本的Ct值均为“无”，结果表明实验中所有被测样品均为ASFV抗原阴性。检测结果见图1。

图1 检测结果

3 讨论

对于非洲猪瘟，世界范围内尚未研制出有效疫苗。在非免疫状态下，使用实时荧光PCR进行非洲猪瘟病毒检测，是目前灵敏度及准确度最高的方法。本实验按照某屠宰场生猪不同来源实施分批，选取32份待宰生猪混合血液样品进行检测，未发现非洲猪瘟阳性的病例。由于目前还没有一个统一的生猪屠宰厂样品采集和检测方面有关的要求，也没有出台规范采样、检测和记录等措施。所以本实验是依据某屠宰场的实验室情况制定的实验标准，供大家参考。

由于非洲猪瘟发病有一定的潜伏期，如果在潜伏期内生猪不发病，也没有异常症状，但仍可能携带病毒，这种带有病毒的生猪也会被出具“有效”的动物检疫合格证明，进入到调运环节被屠企收购。而作为猪肉产品流通的重要守门者之一，屠企是有义务和责任展开相关检测工作，扼守住非洲猪瘟的最后一道防线的。

未来各相关部门须继续关注我国非洲猪瘟疫情发展态势，根据防控形势变化针对性地加强防控检测，针对技术需求，展开联合攻关，坚决打好打赢非洲猪瘟疫病防控战。