一例仔猪猪瘟病毒与大肠杆菌混合感染的调查分析

莫添麟 韦志文 韦成威 李 军 贺会利 潘 艳*

（1.广西河池市水产畜牧产品质量安全检验检测中心，广西河池 547000；2.广西河池市金城江区动物疫病预防控制中心，广西河池 547000；3.广西兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

猪瘟，又称“烂肠瘟”，是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、发热、接触性败血性和高度接触性传染病。具有高度传染病和致死性，猪是本病的唯一宿主。猪瘟病毒（Hogcholera virus，Swine fever virus）是ssRNA病毒，其RNA为单股正链。病毒粒子呈圆形，大小为38～44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。猪瘟是世界动物卫生组织（OIE）规定通报的疫病，也是我国自 2007 年以来一直实行强制免疫的一类传染病。猪瘟疫苗属于国家强制性免疫疫苗，猪瘟疫苗免疫在我国普及率非常高。然而，当前猪瘟在许多地方均有发生，严重危害养殖户的利益。

大肠杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌，周生鞭毛，能运动，无芽孢。是动物体内重要的肠道菌群，大多不致病，属于条件性致病菌。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。致病性大肠杆菌是一种重要的人兽共患病原菌，其血清型复杂。猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的以腹泻为主的仔猪肠道传染病，依据发病仔猪的临床症状、病理剖检变化以及流行病学，将该病分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病等。仔猪发病后发生严重腹泻，并导致脱水，败血症或继发其他疾病，仔猪发育受阻，甚至死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。

1 材料

1.1 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA Synthesis Kit、Taq MasterMix、DL 1500 DNA Marker购自北京康为世纪生物科技有限公司，琼脂糖凝胶购自西班牙GENE公司。血平板培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；微量生化反应管和药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 样品来源

样品来源于2018年广西地区某规模化发病猪的肺脏、脾脏和小肠等病料样品。

1.3 阳性对照

猪瘟病毒阳性疫苗保存于广西兽医生物技术重点实验室由本实验室。

2 方法

2.1 临床症状及剖检变化

病猪精神沉郁，体温升高到40～42℃，持久不退。食欲减退或停食，行走四肢无力，行动迟缓，摇摆不稳，先便秘，后腹泻。对病死猪剖检可见，出血性淋巴结炎，淋巴结肿大，脾脏有边缘性梗死，肾脏有大量出血点，肺脏呈局灶性出血斑，小肠系膜和胃浆膜有点状出血；胃底粘膜溃疡；胃肠粘膜呈现卡他性、出血性炎症变化。

2.2 细菌学检查

整个操作需无菌进行，用接种环取肺脏、脾脏和小肠样品，采用平板划线法，接种在血琼脂培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中过夜培养18-24h后观察，并进行细菌形态学观察及鉴定。

2.3 药敏试验

采用NCCLS推荐的K-B纸片法，选用青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等10类共16种常用抗菌药物进行体外药敏试验，用游标卡尺测量抑菌圈直径（Ф），按照：Ф≥20 mm为敏感，15 mm≤Ф＜20 mm为中介，Ф＜15 mm为耐药的判定标准判读药敏结果。

2.4 PCR方法检测

2.4.1 组织样品RNA/DNA提取 将病死猪脾脏、肺脏、淋巴结等病料样品放入研磨器中混合研磨，加入1.5 ml灭菌生理盐水，收集于2.0 ml的EP管中，-70℃反复冻融3次，8000 r/min离心5 min，取上清液置于另一灭菌的1.5 ml离心管中，12000 r/min离心15min，取上清液，按病毒DNA/RNA提取试剂盒说明进行组织样品RNA/DNA提取。按照HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。提取的病毒核酸-20℃ 保存备用。

2.4.2 引物设计 参照罗廷荣等（2004）方法进行CSFV检测。CSFV检测引物为CSFV-F：（5'-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3'）和CSFV- R：（5'-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3'），扩增长度为508bp。引物由广州华大基因科技有限公司合成。

2.4.3 PCR检测方法 CSFV的反应体系为：2×Es Taq MasterMix 13 µl，上游引物、下游引物各1µl，DNA模板3 µl，ddH2O 7µl，总反应体系 25 µl。瞬时离心混匀，反应程序为95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环后，72℃再延伸10 min。

3 结果

3.1 细菌的分离鉴定

无菌采取送检病料的淋巴结、脾脏和肺脏样品于血琼脂培养基平板上，37℃恒温培养箱中过夜培养后，在淋巴结和脾脏均分离到细菌。经革兰氏染色镜检（如图1），可看到革兰氏阴性杆菌。进行生化试验发现此病原菌可以发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，MR试验阳性。VP试验阴性，动力试验阳性，吲哚试验阳性，不利用枸橼酸盐，也不产生H2S气体。经过以上鉴定，可以确定该分离菌为大肠杆菌。

表1 药敏试验结果

图1 革兰氏染色镜检结果

3.2 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离到的大肠杆菌对呋喃唑酮、痢菌净高度敏感，对头孢曲松钠、头孢拉定、头孢氨苄、多粘菌素、磷霉素中毒敏感，对阿米卡星、壮观霉素、卡那霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、复方恩诺明、强力霉素、安普霉素耐药。

3.3 猪瘟病毒的RT-PCR扩增结果

用RT-PCR的方法对病料样品和阳性样品进行检测，阳性样品的片段大小在508bp，鉴定表明该病料中CSFV为阳性（图2）。

图2 CSFV的PCR扩增电泳结果

4 防治治疗

及时隔离治疗发病猪，对病死猪和无治疗价值的猪采取无害化处理，防止病原扩散。对被污染的圈舍、场地和饲具进行严格彻底的消毒。加强猪场卫生管理，加强免疫，调整免疫程序，给病猪肌肉注射呋喃唑酮，口服痢菌净，饮水中添加柠檬酸 + 口服补液盐连用 1周。

5 小结与讨论

通过实验室检测、临床症状、剖检分析，结果确诊该病猪是由于猪瘟病毒和大肠杆菌混合感染。猪瘟是一种猪的急性接触性传染病，在我国各省都有发生，是威胁养猪业的主要传染病之一，目前的防治措施是免疫接种，中国的猪瘟兔化弱毒疫苗免疫期可达一年以上，已被公认为一种安全性良好、免疫原性优越、遗传性稳定的弱毒疫苗。另外，开展免疫监测，及时淘汰隐性感染带毒种猪，坚持自繁自养，全进全出，做好隔离、卫生、消毒和杀虫工作，可减少猪瘟病毒的侵入。大肠杆菌作为一种条件致病菌，血清型复杂，常在仔猪免疫功能降低时并发感染。规模化养猪场抗生素使用的不规范导致大肠杆菌的耐药性较为严重，治疗上应采取中药为主、抗生素为辅的方法防治，从而减少猪场的损失。