贮藏温度对炝蟹品质的影响

钱佳敏 张进杰,∗ 徐大伦 楼乔明 杨文鸽 胡奇杰

(1宁波大学食品与药学学院,浙江宁波 315000;2湖州市食品药品检验研究院, 浙江湖州 313000)

炝蟹是一种腌制的生食蟹产品,其味鲜美,风味独特,营养价值高,深受消费者喜爱[1]。生产炝蟹的主要原材料是新鲜三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)。梭子蟹是我国重要的近海温暖性大型经济蟹类,2015年我国三疣梭子蟹的总捕捞量高达54 万t,梭子蟹养殖面积超过2 万hm2[2]。但是梭子蟹捕获后极易死亡,同时蟹肉蛋白质在酶和微生物作用下分解生成氨、胺类等碱性含氮物,导致其鲜度和品质迅速下降,且梭子蟹上市季节性强,导致梭子蟹销售价格波动大。而炝蟹具有较长的货架期和更优的价格,所以加工炝蟹是提高三疣梭子蟹产业价值的有效途径之一。炝蟹作为一种腌制生食水产品,在加工过程中不能对其进行高温杀菌,且其炝料中的盐分仅能抑制少部分微生物的生长,因此微生物的增加、较强的酶活等都对炝蟹的食用安全性产生了威胁[3]。研究表明,低温贮藏可以抑制生鲜中华绒螯蟹、梭子蟹、鲐鱼等水产品中微生物的生长和蛋白质的降解[4-6],但其在炝蟹中的应用尚鲜见报道,有关炝蟹在低温储藏过程中的安全性需进一步研究。

动物性食品发生腐败变质一般源于微生物。菌落总数(total viable count,TVC)可以用来判定食品被微生物污染的程度及卫生质量,它可以反映食品在生产、贮藏、运输等过程中是否符合卫生要求,以便对被检样品作出适当的卫生学评价[7]。此外,腐败过程中由蛋白质分解而产生的氨、胺类等碱性含氮物质称为挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)。TVB-N值越高,表明氨基酸被破坏的越多,营养价值受影响越显著。金超等[8]利用TVB-N 值、pH 值和感官评价等指标研究4℃和0℃冷藏条件下三疣梭子蟹的品质劣变,经综合判定得出,三疣梭子蟹在这两种冷藏条件下的贮存期分别为6、8 d。蛋白质变化也主要是微生物降解的作用,所以对微生物的研究是重中之重。生物胺是一类具有脂肪族、芳香族或杂环结构的天然含氮低分子化合物,通常是在微生物所产生的氨基酸脱羧酶的作用下由氨基酸脱去羧基而生成的[9]。研究显示,过量摄入生物胺会导致人体中毒[10],其中毒性最大的是组胺,其次是酪胺,所以通常以这2 种生物胺作为检测指标。生物胺中的尸胺和腐胺毒性较小,但能抑制组胺和酪胺代谢酶的活性,从而增加组胺和酪胺的毒性[11]。国内外对河蟹和海蟹贮藏过程中生物胺变化的研究较多,孟勇等[4]在4、12℃各贮藏9 d 及25℃贮藏48 h 的中华绒螯蟹肉组织中均检测到8 种生物胺,4℃贮藏条件下蟹肉中生物胺含量最低且未检出组胺;Anupama 等[12]对十字花蟹(Charybdis feriatus)4℃贮藏过程中生物胺及其他安全性指标进行检测并进行综合评价得出,十字花蟹4℃贮藏条件下的货架期为144 h。炝蟹产品的一般储运条件为冻藏,而家庭自制炝蟹或炝蟹食用过程中的暂存条件为4℃,而目前有关炝蟹贮运及食用过程中生物胺、微生物等安全性指标及各指标之间关系的研究尚鲜见报道。

本研究以三疣梭子蟹为原料,将其加工处理成炝蟹,研究炝蟹在冷藏(4℃)和冻藏(-18℃)过程中生物胺含量、TVB-N 值和TVC 值的变化规律及生物胺与其他品质指标之间的相关性,并结合感官评价对其贮藏期的安全性进行分析,以期为贮藏过程中炝蟹品质及货架期预测提供理论依据,保障水产品的食用安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活雌性三疣梭子蟹50 只,于2017年9月7日购自浙江宁波江北区路林水产市场,每只质量约200±15 g,购买后2 h 内带回实验室。使用钢丝球刷洗蟹的腹部、蟹体与蟹脚,并逐个用清水冲洗干净,然后放入配好的炝料[饱和盐水+10%烧酒(乙醇含量约5%)]中,置于玻璃密封罐中腌制6 h,拿出沥干(约10 min),最后采用塑封保鲜袋单独包装腌制成熟的炝蟹,即得到炝蟹产品。

氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氧化镁、高氯酸,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;硼酸,天津市博迪化工有限公司;琼脂培养基,杭州微生物试剂有限公司;丙酮、乙腈(色谱纯),南京化学试剂股份有限公司。试验用水均为超纯水。

1.2 主要仪器与设备

Centrifuge 5804 R 高速冷冻离心机, 德国Eppendorf 公司;ZLD-500 高速匀浆机,上海众时机械有限公司;BPS-500CP 恒温恒湿箱,上海一恒科学仪器有限公司;BCD-539WT 冰箱,青岛海尔股份有限公司;LDZF-50KB-Ⅱ立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械有限公司;Kjeltec8400 FOSS 全自动凯氏定氮仪,福斯分析仪器(苏州)有限公司;Waters 2096 高效液相色谱,美国Waters 公司;HH-4 数显恒温水浴锅,国华电器有限公司;SB25-12DTS 超声波清洗器,宁波新芝生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 将炝蟹产品随机分成两组,每组25 只。分别于4℃下冷藏16 d(每2 d 进行一次取样检测)和-18℃下冻藏8 m(m 为month 的缩写,以下均简写为m)(每隔1 个月进行取样,4℃解冻6 h 后取样检测),定期测定炝蟹中生物胺含量、TVB-N 值和TVC值等指标,并同时进行感官评定。

蟹肉取样方法：4℃冷藏和-18℃冻藏(4℃解冻6 h)后的炝蟹产品去除不可食部分,取梭子蟹腹部蟹肉用于各指标测定。每个时间点取3 个平行样。

1.3.2 感官评价 10 名(5 男和5 女)年龄在20 ～25周岁内且经过ISO 8586-2012[13]训练的感官评价员组成评定小组,分别对4、-18℃贮藏条件下不同时期的炝蟹的外观色泽、组织结构、风味和口感4 项指标进行感官评分,各个指标的权重分别为0.2、0.2、0.3、0.3。得分从6 分(质量最好)到1 分(质量最差),最后感官评分为各个指标的权重分之和。以感官评分2.5 分为最低可食用可接受限度值。具体感官评价标准见表1[8,14]。

1.3.3 菌落总数的测定 参照GB 4789.2-2016[15]的方法。

1.3.4 挥发性盐基氮的测定 参照GB 5009.228-2016[16]的方法。

1.3.5 生物胺的检测 参照GB 5009.208-2016[17]的方法。

1.3.6 数据处理 每次试验重复3 次,测定结果以样本的平均值±标准差表示。采用SPSS 21.0 软件中ANOVA 对试验数据进行邓肯氏(Duncan’s)方差分析,显著水平为0.05;用SPSS version 21 作相关性分析,并采用Origin 9.2 绘制图表。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度对炝蟹感官评分的影响

食品品质的好坏首先在感官上得到体现,科学合理的感官评价能反映该食品的特征品质和质量要求,直接影响到食品品质的界定和食品质量与安全的控制[18-19]。由表2 可知,4℃贮藏条件下,随着贮藏时间的延长,炝蟹的综合感官评分逐渐降低,贮藏至第10天时,炝蟹综合感官得分降至3.36 分,蟹肉组织变得较松散,壳肉较易分离,有轻微异味;贮藏14 d 后,其感官评分极低,不能被接受。-18℃低温冷冻贮藏的炝蟹样品,经低温(4℃)解冻6 h 后进行感官评定。随着贮藏时间的延长,炝蟹的感官评分逐渐下降,当贮藏时间超过6 m 时,炝蟹解冻后壳肉分离,蟹肉组织松散糊化显著,口感下降明显,炝蟹特有的鲜味变弱,逐渐达到不可接受程度。综上可知,4℃冷藏炝蟹货架期≤10 d,-18℃冻藏炝蟹货架期≤6 m。此外,与低温冷藏(4℃)相比,低温冻藏(-18℃)下炝蟹的感官评分下降得较慢,即贮藏温度越低,炝蟹可接受的食用期限越长。

表1 炝蟹感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of bloated crab

2.2 贮藏温度对炝蟹菌落总数变化的影响

菌落总数(TVC)常用来评价食品被细菌污染的程度,其在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣[20-21]。根据国际食品微生物委员会(ICMSF)[22]和GB 10136-2015[23]规定,即食生制动物性水产制品菌落总数不得高于5 lg (CFU·g-1)。由图1 可知,在4、-18℃贮藏初期炝蟹的TVC 值分别为1.7、1.5 lg(CFU·g-1),低于生雪蟹[2.50 lg(CFU·g-1)][14]和生蓝蟹[2.50 lg(CFU·g-1)][24]的TVC 值,这与选择的鲜活梭子蟹原材料和炝料中含有较高浓度的食盐和酒精有关。随着贮藏时间的延长,4、-18℃条件下炝蟹的TVC 值均逐渐增大,但4℃条件下TVC 值的增加速率大于-18℃。4℃条件下,炝蟹的TVC 值在贮藏0 ～4 d明显上升,贮藏4～6 d 时TVC 值无明显变化,贮藏6 d后TVC 值又明显上升。冻藏过程中,微生物无法滋生,但-18℃的条件不足以消除酶活,蟹肉的营养成分会发生变化,解冻后对微生物营养供给能力有所不同,此外,冻藏炝蟹是经低温(4℃)解冻6 h 后再进行菌落总数的测定,解冻过程中由于环境温度升高,炝蟹中微生物的复苏滋生会影响最终的TVC 值。-18℃条件下,炝蟹的TVC 值呈逐渐上升趋势,但整体变化幅度不大,贮藏0～2 m 时,炝蟹TVC 值明显上升,贮藏3 m后TVC 值变化不显著。在4、-18℃条件下贮藏至终点时, 炝蟹的TVC 值仍未超过限定值[≤ 5 lg(CFU·g-1)]。综上,-18℃条件下炝蟹TVC 值显著低于4℃条件下的炝蟹,货架期明显延长,说明低温冻藏能有效抑制微生物的生长,这与感官评价结果一致。

表2 不同贮藏温度下炝蟹的感官评分结果Table 2 The sensory scores of bloated crabs under different storage temperature

图1 贮藏温度对炝蟹菌落总数变化的影响Fig.1 Effect of storage temperature on the total viable number of in bloated crabs

2.3 贮藏温度对炝蟹挥发性盐基氮变化的影响

挥发性盐基氮(TVB-N)值可以反映食品中蛋白质分解和腐败的程度[21]。GB 10136-2015[23]规定腌制生食动物性水产品的TVB-N≤25 mg·100g-1。由图2可知,4℃条件下,炝蟹的初始TVB-N 值为1.7 mg·100g-1,贮藏0～14 d 时炝蟹TVB-N 值增加平缓,14 d 后增长迅速;贮藏第14 天时炝蟹TVB-N 值为22.7 mg·100g-1,接近标准限值(25mg·100g-1),贮藏第16天时炝蟹TVB-N 值达到35.5 mg·100g-1,此时炝蟹完全腐败,这与感官评价结果一致。-18℃条件下,随着贮藏时间的延长,炝蟹TVB-N 值缓慢增加。-18℃条件下微生物无法生长,而在TVB-N 检测前的低温解冻过程中,炝蟹样品受到微生物、酶和冻融等因素的作用,促使炝蟹肌肉中蛋白质降解,从而影响测定结果。由此可见,贮藏温度对炝蟹TVB-N 值有显著影响,低温可以有效抑制蛋白质的腐败变质,这也与感官评价结果一致。

图2 贮藏温度对炝蟹TVB-N 值变化的影响Fig.2 Effect of storage temperature on the TVB-N value of blcated crabs

2.4 贮藏温度对炝蟹生物胺含量的影响

生物胺的来源可以分为两种途径[12]：一是游离氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下转变为生物胺,如组氨酸、酪氨酸脱羧分别转变成组胺和酪胺;二是通过醛、酮的氨化作用产生。炝蟹中生物胺种类的含量变化与贮藏条件和贮藏时间有很大的关系。由表3 可知,4℃贮藏期间,炝蟹中共检测出色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺8 种生物胺。其中苯乙胺仅在贮藏第16 天时检出,尸胺仅在贮藏第10 和第16 天时检出,组胺仅在贮藏第14 和第16 天时检出;色胺、酪胺和腐胺是炝蟹贮藏过程中的主要生物胺。除腐胺外,贮藏0～6 d 时炝蟹各生物胺变化不显著,其中,色胺从贮藏8 d(1.46 mg·100g-1)后开始快速增长,至贮藏16 d 时增长为21.42 mg·100g-1;腐胺从贮藏6 d(0.71 mg·100g-1)后开始快速增长,贮藏至16 d 时达到15.73 mg·100g-1;酪胺从贮藏8 d(1.34 mg·100g-1)后开始快速增长, 贮藏至 16 d 增长为 26.55 mg·100g-1。-18℃贮藏期间,炝蟹中共检测出色胺、腐胺、酪胺、亚精胺和精胺5 种生物胺,苯乙胺、尸胺和组胺均未检出。贮藏0 ～5 m 时炝蟹总生物胺含量增长缓慢,而贮藏5 ～8 m 时其总生物胺含量迅速增加至39.18 mg·100g-1。色胺、酪胺和腐胺是炝蟹贮藏过程中的主要生物胺,0～4 m 贮藏期间中炝蟹各生物胺变化不显著,其中色胺和腐胺均从贮藏第6个月后开始快速增长,贮藏8 m 时,色胺、腐胺含量分别为8.49、11.59 mg·100g-1; 酪胺从贮藏第5 个月(1.75 mg·100g-1)开始增长,贮藏8 m 时,其含量达到16.41 mg·100g-1。

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亚精胺和精胺均属于多胺,其在生物体的生长过程中能促进DNA、RNA 和蛋白质的合成,加速生物体的生长发育[25]。4、-18℃条件下,整个贮藏期间亚精胺含量相对较稳定,而精胺含量在贮藏后期均略有降低,但变化无规律,这与冯杰等[26]的研究结果类似。综上,冻藏可以有效抑制炝蟹中生物胺的生成,以色胺、腐胺、酪胺的抑制效果最为明显。食品中过量的生物胺会引起异味[27],炝蟹经冷藏10 d 或冻藏6 m 后,不适宜的气味导致感官评分较低,与感官评分结果一致。

2.5 炝蟹生物胺与其他理化指标的相关性分析

由表4 可知,色胺、腐胺、酪胺与感官评分差值相关性最强,其相关系数和(∑r)分别为1.778、1.691 和1.614。4℃条件下色胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺与感官评分差值、TVC 值、TVB-N 值表现出极显著相关性;而-18℃条件下仅有色胺、腐胺、酪胺与感官评分差值表现出极显著相关性,与TVB-N 值有显著相关性色胺、腐胺与TVC 值也表现出显著相关性,但酪胺与TVC 值相关性不显著。综上,炝蟹中生物胺含量与TVC 值和蛋白质的分解(挥发性盐基氮)紧密相关,其中色胺、腐胺、酪胺含量与感官评价差值、TVC 值、TVB-N 值均表现出高度相关性,因此,可将这3 种生物胺作为炝蟹的特征生物胺,用于评价炝蟹腐败程度的参考指标。亚精胺和精胺是组成性胺类,含量不受微生物腐败的影响,所以相关性系数出现了负值,这与孟勇等[4]的研究结果一致。

表4 生物胺与感官评分差值、TVC 值、TVB-N 值的相关性Table 4 Correlation of biogenic amines with sensory evaluation differences, TVC value, and TVB-N value

2.6 生物胺预测模型

对炝蟹色胺(y1)、腐胺(y2)、酪胺含量(y3)与感官评分(x1)、TVC 值(x2)、TVB-N 值(x3)进行相关性分析,建立回归方程：

回归方程(1)、(2)、(3)的回归系数(R2)分别为0.853、0.797、0.773。回归方程具有统计学意义,说明运用感官评分、TVC 值、TVB-N 值预测色胺、腐胺、酪胺含量的模型可行且效果较好。

随机选取一组4、-18℃条件下炝蟹贮藏期间的指标数据,随机选取10 个数据代入上述公式求出预测值,并与原始数据进行回归分析(图3)。结果显示,色胺、腐胺、酪胺含量的R2分别为0.934 3、0.880 0、0.965 0,且用单变量线性模型检验拟合直线与方程y=x 不显著,说明预测值与实际值差别不大。因此,可以采用该模型对炝蟹在相应条件下贮藏过程中炝蟹的色胺、腐胺和酪胺含量进行模拟预测。

3 讨论

贮藏温度是影响水产品品质的关键因素。周果等[5]发现冰温比冷藏更能有效地延长梭子蟹的货架期;郑平安等[6]认为低温能有效减缓鲐鱼在贮藏过程中的鲜度变化。本试验通过感官评定对贮藏期炝蟹的外观色泽、组织结构、风味和口感进行直观判断,结果表明,炝蟹在4℃下贮藏10 d 和-18℃下贮藏6 m 超过可接受限度,说明低温能够让炝蟹保持较长时间的风味,并具有良好的口感,同时也延长了炝蟹的货架期,这与前人的研究结果一致。

水产品的腐败变质主要是由于某些微生物的滋生导致,微生物分泌蛋白酶分解食品蛋白质造成腐败变质[27]。三疣梭子蟹肉富含蛋白质等营养物质,贮藏过程中在微生物的作用下,蛋白被破坏,产生氨及胺类等碱性含氮物质,导致炝蟹组织结构松软且鲜度大大降低。随着贮藏时间的延长,4、-18℃条件下炝蟹的TVC 值和TVB-N 值均逐渐增大。不同贮藏条件和时间下炝蟹中TVB-N 值的增长速率不同,4℃条件下的增长速率较明显,这与前人对雪蟹[14]、鲈鱼[28]和南美白对虾[29]的研究结果一致,但与Anacleto 等[30]对煮熟过夜冷藏于4℃的黄道蟹研究得出的TVB-N 值随着时间的延长呈现先增高后下降再增高的趋势结论不一致。-18℃条件下,炝蟹TVB-N 值在贮藏第3 个月下降,这与王亚会[20]的研究结果一致。

过量的生物胺会引起许多不良的生理反应[10],因此,生物胺也已被广泛应用于水产品品质评价。本试验中,色胺、腐胺和酪胺作为炝蟹的优势胺类,含量总体呈不断上升的趋势,且与感官品质变化呈现出高度一致性。根据国家标准中规定水产品中组胺的限值为40 mg·100g-1[31],美国食品及药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)规定食品中生物胺总量≤1 000 mg·kg-1、酪胺含量≤100 mg·kg-1标准,4℃条件下冷藏14 d 和-18℃下冻藏8 m 时炝蟹酪胺含量超过了FDA 规定的限值;食品中的色胺一般要求低于3 mg·100g-1[32],而炝蟹在4℃条件下冷藏10 d 和-18℃下冻藏7 m 后其色胺值均超过一般含量值。

部分研究学者在研究水产品的保鲜过程中会将生物胺与TVC 值、TVB-N 值分开进行讨论,但生物胺产生与微生物的活动、含氮类物质的变化密不可分。雷志方等[21]研究温度对金枪鱼品质影响及生物胺相关性,结果表明,组胺、酪胺、尸胺与TVB-N 值和TVC 值之间相关性极显著,可作为评价金枪鱼新鲜度的参考指标;陈玉峰等[33]研究腌干鱼贮藏过程生物胺与理化指标之间的相关性发现,单胺的相关性最高;孟勇等[4]研究不同贮藏温度下中华绒螯蟹生物胺与TVB-N 值的相关性发现,腐胺、尸胺、组胺、酪胺与TVB-N 值的相关性最显著。本试验结果表明,色胺、腐胺、酪胺与其他评价指标的相关性最显著,这与前人研究结果相似。此外,本研究仅对4℃和-18℃贮藏过程中炝蟹肉的感官品质、TVB-N 值、TVC 值和生物胺等指标进行了检测和分析,有关炝蟹蟹膏(肝胰腺和性腺部分)贮藏过程中品质变化仍在研究中。

4 结论

冷藏(4℃)组和冻藏(-18℃)组炝蟹的感官评分随着贮藏时间的延长而下降,其货架期分别为10 d 和6 m。炝蟹在冷藏和冻藏过程中,TVC 值、TVB-N 值及3 种主要生物胺(色胺、腐胺、酪胺)含量总体呈上升趋势,但冻藏组的变化速率较冷藏组缓慢。低温贮藏能有效抑制炝蟹中苯乙胺、尸胺、组胺的产生,对亚精胺和精胺的含量无显著影响。相关性分析显示,色胺、腐胺、酪胺含量与炝蟹贮藏期各品质指标劣变关系紧密。因此,冻藏的方式对保持炝蟹品质具有良好效果,适宜于炝蟹的长期保存,能极大地提升其商业价值。