LAMP十三联检在重症肺炎病原菌检测中的应用价值

陈炎城 朱旭华 曾汉华

【摘要】 目的：探究并比較环介导恒温扩增芯片法（LAMP）在重症肺炎病原菌检测中的应用价值。方法：收集2017年1-12月本院收治的87例重症肺炎患者的分泌物标本，包括深部痰液、支气管吸出物、肺泡灌洗液，同时实施LAMP十三联检与痰培养检查，观察两种检查方法病原菌检出情况，并对比病原菌检出阳性率。结果：87例标本中痰培养检查病原菌为22例（25.29%），以铜绿假单胞菌（31.82%）为主且为单一病原菌感染;LAMP十三联检显示阳性标本41例（47.13%），其中单一病原菌感染24例（27.59%），混合病原菌感染17例（19.54%），以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（31.25%）及肺炎克雷伯菌（18.75%）为主，20～60岁、>60岁人群均以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染为主，不同年龄段结核分枝杆菌复合群感染比较，差异有统计学意义（P<0.05）;LAMP阳性率为47.13%，高于痰培养的25.29%（P<0.05），结核分枝杆菌复合群、肺炎衣原体及流感嗜血杆菌等部分病原菌痰培养未检测出。结论：在重症肺炎病原菌检测中，LAMP十三联检可为临床治疗提供可靠实验室诊断依据，患者以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染为主，为提高检测准确率可根据实际情况联合其他检测方法，指导用药。

【关键词】 环介导恒温扩增芯片法; 痰培养; 重症肺炎; 病原菌

【Abstract】 Objective：To explore and compare the application value of loop-mediated isothermal amplification（LAMP）in pathogenic bacteria detection of severe pneumonia.Method：Secretion specimens of 87 patients with severe pneumonia admitted to our hospital from January 2017 to December 2017 were collected，it included deep sputum，bronchial aspirates and alveolar lavage fluid，at the same time，LAMP and sputum culture were carried out，the detection of pathogenic bacteria by two methods were observed，and the positive rate of pathogenic bacteria was compared.Result：Of 87 specimens，22 cases（25.29%）were pathogenic bacteria by sputum culture，pseudomonas aeruginosa（31.82%）was the main pathogen and only one pathogen was infected.LAMP showed that 41 cases（47.13%）positive specimens，including 24 cases（27.59%）of single pathogen infection，17 cases（19.54%）of mixed pathogen infection，mainly methicillin-resistant Staphylococcus aureus（31.25%）and Klebsiella pneumoniae（18.75%）.People aged 20-60 years and over 60 years were mainly methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection，with tuberculosis branches in different age groups，there was significant difference in Bacillus complex infection（P<0.05），the positive rate of LAMP in lower was 47.13% higher than 25.29% in sputum culture（P<0.05），some pathogenic bacteria such as Mycobacterium tuberculosis complex，Chlamydia pneumoniae and Haemophilus influenzae were not detected in sputum culture.Conclusion：In the detection of pathogenic bacteria in severe pneumonia，LAMP can provide reliable laboratory diagnostic basis for clinical treatment，methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection is the main pathogen in patients.In order to improve the detection accuracy，other detection methods can be combined according to the actual situation to guide drug use.

【Key words】 Loop-mediated isothermal amplification; Sputum culture; Severe pneumonia; Pathogenic bacteria

First-authors address：Meizhou Peoples Hospital，Meizhou 514000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.17.043

重症肺炎是临床多发性疾病，发病急、进展快，以咳嗽、咳痰为主要临床症状，随着病情加重，甚至出现呼吸衰竭、多器官功能障碍等，具有较高死亡率，多数患者被确诊后将转入重症监护室（intensive care unit，ICU）救治，而选择有效抗菌药物是降低患者死亡率的关键问题[1-2]。但随着抗生素在临床治疗的广泛应用，耐药菌株增加将影响患者治疗效果，因而需及时准确分析病原菌构成，准确判断病情，给予合理抗生素药物，从而减少医疗费用，减轻治疗痛苦。痰培养是目前普遍应用的病原菌检测技术，但培养时间较长，易导致患者错过最佳治疗时机，效果欠佳[3]。环介导恒温扩增芯片法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）十三联检作为新型检测技术，操作简便快捷，并因敏感度及特异度较好而在病原菌检测中广泛应用[4]。为探究LAMP检测技术在临床重症肺炎病原菌检测价值，本研究选取87例患者分泌物标本分别实施LAMP十三联检与痰培养检查并比较，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年1-12月本院收治的87例重症肺炎患者的分泌物标本，包括深部痰液、支气管吸出物、肺泡灌洗液，其中男61例，女26例，年龄16～89岁，平均（65.84±6.91）岁，均来自ICU，纳入标准：（1）所有患者均经胸部影像学、体温、血象等检查确诊为重症肺炎，并符合重症肺炎感染标准[5];（2）年龄>16岁。排除标准：（1）心肝肾等严重功能不全;（2）自身免疫性疾病、血液系统疾病;（3）临床资料不完整及不配合检查者。经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 LAMP十三联检检测 收集所有患者分泌物标本，并提取标本核酸，在65 ℃恒温条件下利用有链置换功能聚合酶进行靶核酸扩增，并掺入荧光染料行实时荧光检测，最后利用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪（北京博奥生物集团）及LAMP试剂盒（日本荣研化学株式会社）对结果进行分析，十三联检检测病原菌类型为：（1）肺炎衣原体;（2）肺炎支原体;（3）肺炎链球菌;（4）金黄色葡萄球菌;（5）大肠埃希氏菌;（6）肺炎克雷伯菌;（7）铜绿假单胞菌;（8）鲍曼不动杆菌;（9）嗜麦芽窄食单胞菌;（10）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;（11）结核分枝杆菌复合群;（12）流感嗜血杆菌;（13）嗜肺军团菌。并分析不同年龄<20岁、20～60岁、>60岁病原菌检测情况。

1.2.2 痰培养检测 根据《全国临床检验操作规程》进行标本检测[6]，对无菌接种环进行常规消毒，待冷却后将标本分别接种中国蓝琼脂平板（青岛海博生物技术有限公司）、血琼脂平板及巧克力琼脂平板（均由英国oxoid公司提供），若有真菌感染接种于念珠菌显色平板（上海抚生实业有限公司）。随后将平板置入GSP-9080MBE隔水式电热恒温培养箱（青岛正恒试验设备有限公司）35 ℃，孵化24 h后观察平板各菌落生长状况，再取单个菌落进行革兰染色鉴定，最后应用法国梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统检测各病原菌，以检出病原菌定义为阳性。

1.3 观察指标 观察两种检查方法病原菌检出情况，并对比病原菌检出阳性率。

1.4 统计学处理 所有数据应用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计数资料以百分数（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰培养检查结果 87例标本中痰培养检查病原菌为22例，阳性率为25.29%，以铜绿假单胞菌（31.82%）为主，均为单一病原菌感染，未检测出混合细菌感染，病原菌种类及构成比见表1。

2.2 LAMP十三联检检查结果 在LAMP十三联检中，87例中阴性标本46例（52.87%），阳性标本41例（47.13%），其中单一病原菌感染24例（27.59%），混合病原菌感染17例（19.54%），共检出病原菌10种，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出率最高（31.25%，20/64），其次为肺炎克雷伯菌（18.75%，12/64），未检测出肺炎支原体、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌3种病原体。不同年龄段结核分枝杆菌复合群感染比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中20～60岁、>60岁人群均以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染为主，见表2。

2.3 LAMP十三联检与痰培养检查结果比较 87例标本中，LAMP十三联检阳性率为47.13%，明显高于痰培养的25.29%，差异有统计学意义（字2=8.062，P=0.005）。与LAMP十三联检比较，痰培養未检测出结核分枝杆菌复合群、肺炎衣原体及流感嗜血杆菌，但检测出浅黄假单胞菌及白色假丝酵母菌。

3 讨论

多数重症肺炎患者需入住ICU治疗，局部或全身免疫功能低下，死亡率较高，给社会及家庭带来了沉重的经济负担。近年来抗生素药物研究不断发展进步，但患者死亡率未发生明显变化，反而因抗生素滥用使耐药菌株日益增多，因此明确患者感染病原菌对确立正确治疗方案、控制感染、改善预后具有积极作用[7-8]。病原菌检测是当前诊治重症肺炎有效手段，通过判断病原菌指导抗生素治疗，降低耐药率。痰培养作为传统病原菌检测方法，可为临床治疗提供病原学依据，指导用药，但影响因素较多，若未及时送检易导致定植菌死亡或无法检测需经特殊条件培养细菌，敏感性较差，延误治疗[9-10]。因此，尽早建立高敏感度、高准确度、便捷高效病原菌检测方法是临床诊治重症肺炎亟待解决问题。

随着分子生物学检测技术不断发展进步，LAMP作为新型核酸扩增技术，从在传统PCR技术发展而来，具有较高敏感度、特异度等优势，可应用结核分枝杆菌、HBV、HIV等疾病检测中，并获得国际认同，成为成熟且重要的检测手段[11]。LAMP的4对特异性引物是针对靶基因6个不同特殊区域设计，因此，若6个区域任意一个与引物间不相匹配将影响核酸扩增，具有较高特异度[12]。随后在高活性链置换DNA聚合酶帮助下使链置换DNA合成不断循环，并在65 ℃左右恒温条件下进行等温扩增，故其因在恒温条件下即可进行核酸扩增，完成相关反应，则不必应用热循环仪，从而缩短检测时间[13-14]。此外，结果判定简单便捷，在扩增过程中，加入荧光染料，可通过观察反应液颜色对结果进行判读，无需电泳即可观察扩增效果[15]。因此，LAMP十三联检其仪器设备成本较低，操作方便，扩增速度快，可在30～60 min内获得结果，更适用于基层检测，并且病毒扩增模板达致几个拷贝。LAMP虽可提高检测准确率，但LAMP十三联检容易受污染，并在疾病高发季节中，未能建立多通道检测，且产物克隆、单链分离等方面也存在不足，影响检测结果，故需医师在临床实际工作中按步骤严格操作，加强质量控制，并结合实际情况联合其他检测技术，提高病原菌检出率，以控制病情，提高预防治疗效果。

本研究显示痰培养检查87例标本阳性率为25.29%，以铜绿假单胞菌为主，并检测出白色假丝酵母菌及浅黄假单胞菌各1例，未发现混合病原菌感染，而LAMP十三联检显示阳性率为47.13%，明显高于痰培养（P<0.05），且检出混合病原菌感染17例，发现结核分枝杆菌复合群、肺炎衣原体及流感嗜血杆菌等病原菌，可见LAMP检测技术作为一种新型病原菌检测技术更为便捷、准确，明显优于痰培养，也充分表明其在混合感染检测中发挥独特优势，便于医师采取针对性抗菌药物控制病情，具有临床推广应用的价值，但两种检测方法各有优势，针对痰培养应用价值尚需进一步探究。此外，LAMP检测显示患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出率最高，可能因标本主要来源于老年人存在密切联系。结果还显示，不同年龄段结核分枝杆菌复合群感染比较，差异有统计学意义（P<0.05），可见随着年龄增长，感染病原菌存在差异性，故临床进行病原菌检测过程中可考虑年龄因素，提高检出率。而且20～60岁、>60岁人群均以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染为主，提示该病菌成为患者感染主要致病菌，感染率较高，需引起重视，积极进行病原菌检测，合理使用抗生素，控制病情。

综上所述，LAMP十三联检可快速检测病原菌，为临床治疗提供可靠依据，明显优于痰培养检测，而且设备简单、易操作，可在基层医院推广应用。但本研究受纳入对象偏少、年龄层次分布不均等因素影响，研究结果可能有所偏移，后期研究序进行大样本、多中心深入探究，提高患者病原菌检出效果。

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（收稿日期：2019-03-29） （本文编辑：张爽）