复配拮抗菌FP246 对烟草黑胫病和根际土壤微生物群落功能多样性的影响

张 维，刁朝强，李 斌，包自超，张家韬，林北森，陈德鑫*

1. 中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11 号 266100

2. 贵州省烟草公司贵阳市公司，贵阳市南明区华坤大厦 550001

3. 中国烟草总公司四川省公司，成都市高新区世纪城路936 号 610041

4. 中国烟草总公司山东省公司，济南市高新区龙奥北路1067 号 250101

5. 中国烟草总公司陕西省公司，西安市雁塔区雁南四路19 号 710000

6. 中国烟草总公司海南省公司，海口市琼山区红城湖路22 号 571199

烟草黑胫病（Tobacco black shack）是由寄生疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotiana）引起的一种毁灭性土传病害，每年给烟草生产造成巨大的经济损失［1］。目前，烟草黑胫病的防治主要以化学防治为主，但长期施用农药造成的污染问题，对烟草安全及人类健康都存在直接或间接的危害［2］。生物防治作为一种新型的病害防治措施，不仅对植物具有防病促生的作用，而且能有效克服生产中存在的农药残留和病菌抗药性问题［3-4］。周京龙等［5］研究表明，生防菌不仅对土传病害的病原菌具有抑制作用，而且可以诱导植株产生抗病性，增强自身免疫力。杨秀荣等［6］利用生防细菌B579 处理黄瓜种子后，黄瓜立枯病得到有效控制，并促进了黄瓜生长。目前，利用生防细菌防治烟草黑胫病也取得了一定的成效。徐同伟等［7］发现从土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YBM-4 菌株，对烟草黑胫病菌具有较强的拮抗作用。杨艺炜等［8］研究发现，菌株XF10 的发酵液及其挥发性代谢产物能较好地抑制烟草黑胫病菌的生长。然而，单一生防细菌的药效期短、作用对象单一、易受自然环境影响、竞争存活能力有限且在田间的稳定性差。郭桥燕［9］研究表明，复配拮抗菌对烟草黑胫病的防治效果远高于单一菌株。为此，利用盆栽试验和Biolog-ECO 技术，探究了复配拮抗菌FP246 对烟草黑胫病的防治效果，并分析了复配拮抗菌FP246 对根际土壤微生物群落多样性的影响，旨在为复配生防菌在烟叶生产中防治黑胫病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种为红花大金元，由中国农业科学院烟草研究所提供。盆栽试验所用土壤取自中国农业科学院烟草研究所即墨基地，该土壤未施用过供试菌剂。

供试菌剂：复配拮抗菌FP246［由沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）YJC-4、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CY106 和CY111 组成，在中国农业科学院烟草研究所分离获得］，10 亿个/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（潍坊万胜生物农药有限公司），58%甲霜锰锌可湿性粉剂（陕西省西安市植丰农药厂）。

仪器：R71MHD15ZH 电子天平（感量0.1 g，常州奥豪斯仪器有限公司）、Multiskan GO 1510 酶标仪（美国Thermo 公司）、Eppendorf Minispin 离心机（德国Eppendorf 公司）、Biolog 微生物鉴定系统（型号GEN ⅢMicroStation，美国BioTek 公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

烟苗种植于中国农业科学院烟草研究所人工气候室（温度28 ℃，相对湿度60%），待烟苗生长至5～6 片真叶时进行移栽。共设4 个处理：T1 处理为复配拮抗菌FP246 菌液（OD600=0.10±0.02）；T2处理为10 亿个/g 枯草芽孢杆菌粉剂（2 mg/mL）；T3 处理为58%甲霜锰锌可湿性粉剂（3 mg/mL）；T4 处理为等量清水，即空白对照。每个处理3 次重复，每个重复20 株烟苗。

烟苗移栽后7 d 开始施用药剂，每株灌根20 mL，每隔7 d 施用1 次，共施用3 次。在施药后第23 天，用手术刀在烟苗茎基部刮一伤口，深度至髓部，将烟草黑胫病菌菌饼贴于伤口处，并用脱脂棉保湿［10］。

1.2.2 调查及计算方法

参照标准GB/T 23222—2008［11］方法，在接种黑胫病菌后7 d 调查对照组和处理组的发病率和病情指数，并计算相对防治效果。

发病率=（发病株数/调查总株数）×100%

病情指数=［∑（各级病株或叶数×该病级值）/（调查总株数或叶数×最高级值）］×100

相对防治效果=［（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数］×100%

1.2.3 Biolog-ECO 微生物群落功能多样性分析

1.2.3.1 土壤样品采集

第一，对“集合”概念的认识存在偏差.“集合”是不定义的概念，只要学生感知，明白是什么就可以.不必深究它的内涵，这也是教科书本节内容标题为“集合的含义及其表示”而非“集合的概念及其表示”的用意.教科书在习题中给出的“阅读题”有这样的叙述：一位渔民非常喜欢数学，但他怎么也想不明白集合的意义.于是，他请教数学家：“尊敬的先生，请你告诉我，集合是什么？”集合是不定义概念，数学家很难回答那位渔民.有一天，他来到渔民的船上，看到渔民撒下鱼网，轻轻一拉，许多鱼虾在网中跳动.数学家非常激动，高兴地告诉渔民：“这就是集合！”[1]

当对照组发病率达到50%时，采用多点混合法随机收集土壤样品［12］。小心挖出育苗盆中整株烟苗，抖掉根系外围土保留根际土，同时去除根系杂物，经室内自然风干后过1 mm 筛。随后土样保存于-80 ℃冰箱，用于Biolog 微生物鉴定分析。

1.2.3.2 Biolog-ECO 微平板接种

ECO 接种液制备方法：①供试土样在室温下活化24 h 后，取10 g 土样于100 mL 无菌三角瓶，加45 mL 无菌水。置于28 ℃振荡培养箱（180 r/min）培养30 min 后，取1 mL 泥浆于1.5 mL 离心管中。②10 000 r/min 离心20 min，弃去上清液，加1 mL 无菌生理盐水（0.85% NaCl）在振荡器上混匀5 min（此步骤重复3 次，以除去碳源）；弃去上清液，加1 mL 无菌生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀，2 000 r/min 离心1 min。③取上清液加入装有生理盐水的试管中，使其OD590=0.13±0.02。④在Biolog-ECO 微平板每个样品孔中加150 μL 接种液，每个样品重复3 次。 将接种好的Biolog-ECO 微平板用自封袋装好，置于28 ℃恒温箱中培养。分别于0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 用Biolog 微平板读数仪测定吸光度。

1.2.3.3 多样性指数计算方法

微生物代谢强度采用每孔平均颜色变化率（AWCD）进行描述［13］。土壤微生物群落代谢多样性指数选取Shannon-Wiener 指数、Simpson 优势度指数、McIntosh 指数、丰富度指数进行表征［14-17］。

式中：Ci为第i 个非对照孔吸光值；R 为对照孔吸光值；N 为培养基碳源种类数。

式中：Pi表示第i 个非对照孔中的吸光值与所有非对照孔吸光值总和的比值，即Pi=（Ci-R）/∑（Ci-R）。

式中：ni是第i 个孔的相对吸光值（Ci-R）。

丰富度指数（S）指被利用的碳源总数目，即每孔（Ci-R）的值大于0.25 的孔数。

1.2.4 主成分分析（PCA）

Biolog-ECO 微平板由空白对照孔及31 种单一碳源孔组成，微生物通过每孔吸光值变化度来反映碳源的代谢特征。但这种多元的特征向量不易比较微生物间的代谢差异，因此利用SPSS 软件将复配拮抗菌FP246 在不同培养时间下的每种碳源吸光值，通过降维的方式将多元特征向量吸光值变成2 个无关的主元向量PC1 和PC2，在二维空间比较不同微生物间的代谢差异。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0 软件进行数据处理，多样性指数及主成分分析采用240 h 土壤AWCD 值进行计算［18］，绘图使用Origin 2018 软件。

2 结果

2.1 复配拮抗菌FP246 对烟草黑胫病的盆栽防治效果

由表1 可知，T1 处理烟草黑胫病的发病率为21.67%，与T3 处理差异不显著，与T2 及T4 处理差异显著。T1 处理烟草黑胫病的病情指数为9.45，与对照T4 处理差异显著。T1 处理的防治效果为85.40%，略低于T3 处理，但优于T2 处理。盆栽防效试验表明，复配拮抗菌FP246 对烟草黑胫病具有较好的防治效果且高于单一拮抗菌YJC-4［7］。

表1 不同处理下烟草黑胫病的盆栽防治效果①Tab.1 Control efficacies of different treatments on tobacco black shank in pot experiment

2.2 不同接种时间微生物代谢功能的AWCD 变化特征及主成分分析

由图1 可知，随着接种时间的增加，AWCD 值呈S 型变化趋势。各个处理在0～24 h 的时间范围内不具有统计学意义。接种24 h 后，4 个处理AWCD 值的曲线斜率变大，在168 h 后趋于平稳。比较各处理间AWCD 的最大值发现：T3＞T1＞T2＞T4，其中T3 处理与T1 处理之间的差值较小，但二者均与T2 处理间存在明显差异。此外，清水对照T4 处理的AWCD 最大值显著低于其他3 组处理。

图1 不同处理根际土壤微生物AWCD 值的变化Fig.1 Variation of AWCD of rhizosphere microorganisms under different treatments

AWCD 值变化幅度越大代表微生物的碳源代谢力越强、丰富度越大［19］。对复配拮抗菌FP246在不同接种时间下的AWCD 值进行主成分分析，从31 种因子中提取4 个主成分因子，其中PC1、PC2 主成分得分贡献率分别为64.98%和30.33%，累计贡献率为95.31%。对PC1、PC2 主成分的得分进行作图（图2）表明，接种72 h 的得分在第3 象限、与其他培养时间点距离较远，表明碳源在72 h时与其他时间点的利用情况差异显著。虽然96 h在PC2 轴上的得分略高于120 和144 h，但后者均位于第1 象限，且距离极为接近，同时二者得分在PC2 轴上与其他时间点的距离较远，说明接种120和144 h 对微生物碳源的利用情况有显著影响。而接 种168、192、216、240 h 的 得 分相近，说明Biolog-ECO 微平板在接种168 h 及以后，微生物对碳源的利用情况相似，且无明显差异。主成分分析结果表明，在Biolog-ECO 微平板接种96～144 h时间段内，微生物对碳源的利用较为活跃，并与其他时间段存在显著差异。

图2 AWCD 值的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of AWCD

2.3 不同接种时间微生物群落的多样性分析

图3 培养时间对根系微生物多样性指数的影响Fig.3 Effects of incubation time on diversity index of rhizosphere microorganisms

图3 表明，接种过程中，不同处理的微生物群落多样性指数发生了变化。在接种72 h 后，T1、T3 处理的Shannon-Wiener 多样性指数均高于T2、T4 处理，表明经T1、T3 处理后的土壤微生物多样性高于T2、T4 处理。在不同接种时间，McIntosh指数整体上为T3＞T1＞T2＞T4，且同一时间点不同处理之间存在显著差异。随接种时间的增加，McIntosh 指数呈上升趋势，在168 h 后趋于平稳。在接种96～240 h 期间，T1、T2、T3 处理的Simpson优势度指数变化不大，而T4 处理先上升后趋于平缓。丰富度指数结果显示，T1 和T3 处理均与T2、T4 处理存在显著差异，并且在接种培养168 h 以后，各处理的丰富度指数趋于稳定。

2.4 微生物对不同碳源的利用特征

ECO 微平板含有31 种碳源，分别为胺类（苯乙基胺、腐胺）、糖类（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖内脂、D-木糖、I-赤藻糖醇、D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄胺、D-纤维二糖、葡萄糖-1-磷酸盐、α-D-乳糖、D,L-α-甘油）、酚酸类（2-羟苯甲酸、4-羟基苯甲酸）、羧酸类（丙酮酸甲脂、D-半乳糖醛酸、γ-羟基丁酸、D-葡萄胺酸、衣康酸、α-丁酮酸、D-苹果酸）、氨基酸类（L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸-L-谷氨酸）、聚合物类（吐温40、吐温80、α-环糊精、肝糖）［20-21］。通过测定不同碳源的平均吸光值，可以从侧面反映微生物对各类碳源的利用情况。由图4 可知，在接种96～240 h 期间，每个处理对糖类均有较高程度的利用，且均与T4 处理存在显著差异。各处理在接种120 h 后，微生物对氨基酸的利用趋于稳定，其中T3 处理利用氨基酸的程度略高于T1 和T2 处理。对羧酸类物质的利用程度，T1处理在72～240 h 均高于其他处理，表明T1 处理利用羧酸类物质的能力比T3 处理更强。随着接种时间的延长，微生物对聚合物类物质的利用整体上呈T2＞T1＞T3＞T4。此外，各处理对胺类和酚酸类物质的利用程度显著低于上述碳源，但均高于对照处理。综上，微生物对糖类、氨基酸类、羧酸类以及聚合物类物质的利用程度较高，且对这4类碳源的利用在接种120 h后变化趋于平缓。

图4 培养时间对微生物碳源利用的影响Fig.4 Effects of incubation time on carbon source utilization of microorganisms

3 讨论

Biolog-ECO 技术能快速反映微生物群落的特征变化［22］。土壤微生物群落多样性指数越高，其多样性越丰富，则土壤微生态功能越稳定。本研究中，与对照相比，各处理AWCD 值和群落多样性指数均显著升高。可能原因：①土壤中营养物质丰富、适宜微生物的生长；②外源功能菌施入后大量繁殖，微生物种类和数量大幅度增加，对微平板中的碳源利用能力增强，与刘辉等［23］研究结果一致。主成分分析可用点的位置直观反映土壤微生物群落多样性的变化，并且样品的得分与相似度呈反比［24-25］。主成分分析结果显示，复配拮抗菌PF246 在接种120 h 和144 h 的得分极为相似，且与96 h 的得分接近。结合发病情况进行分析，在接入黑胫病菌96 h 后，黑胫病开始进入盛发期，增加土壤微生物对碳源的利用量，从而增强微生物的活性，丰富微生物群落的多样性。此外，枯草芽孢杆菌对氨基酸具有一定的趋化性，可以促进其他物质的合成。本研究中，T2 处理对氨基酸及聚合物的利用程度大于T1处理，与其他研究结果相似［26-27］。T1、T2、T3 处理后均能提高黑胫病的防治效果，增加土壤微生物的多样性，提高碳源的利用程度，可能是因为土壤微生物产生的代谢物质能影响植物根系细胞的通透性，促进植物对水分和营养元素的吸收，并能诱导植物产生抗病性，从而提高植株的抗病性，减轻病害的发生［28］。

农药的使用会对土壤微生物产生不同程度的影响，即使较低浓度也能引起微生物群落发生明显变化［29-31］。杨琴［32］发现甲霜锰锌在一定浓度范围内对土壤微生物的数量具有激活作用，可增加微生物多样性指数，与T3 处理后的结果基本一致。农药处理后微生物多样性增加，可能是由于农药对土壤环境结构修饰后，改善了微生物的营养状况，使土壤有机物质更易被吸收利用，从而使土壤有益微生物的种类和数量得以增加，但具体原因有待进一步研究。

4 结论

①与单一拮抗菌YJC-4 相比，复配拮抗菌FP246 提高了烟草黑胫病的防治效果。②复配拮抗菌FP246 处理后增强了土壤微生物的碳源代谢能力，提升了微生物的丰富度。在接种培养96 h后，微生物对碳源的利用能力明显升高。③3 个处理的Shannon-Wiener 多样性指数、McIntosh 指数、Simpson 优势度指数、丰富度指数均显著高于对照，表明土壤微生物的种类、数量、群落多样性增加。④土壤微生物对碳源的利用程度升高，特别是糖类、氨基酸类、羧酸类、聚合物类物质。