气相色谱-串联质谱检测新鲜烟叶中的萜类成分

郑庆霞，刘萍萍，陈千思，翟 妞，徐国云，张 慧，金立锋，陈 霞，周会娜

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

萜类成分是植物中重要的次生代谢产物，对植物的生长发育以及抵御外界侵害［1-2］等具有重要的作用。烟草中的萜类成分除了具有调节烟草生长、增强抗逆性等生理功能外［3］，还与烟草香气品质密切相关［4-5］，是衡量烟草品质的重要指标。因此，准确检测烟草中萜类成分的含量是研究萜类成分代谢途径、提高萜类成分含量、解析烟草香气品质的重要前提。

国内外用于萜类成分检测的方法主要有紫外分光光度法［6］、高效液相色谱法［7］、气相色谱法（GC）［8］、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）［9-10］及气相色谱-质谱联用法（GC-MS）［11］等。紫外分光光度法主要用于测定萜类成分总量，而对于萜类成分的快速分离和检测，色谱法具有显著优势。高效液相色谱法的分离效果好且分析速度快，适用于分析极性及难挥发性成分；气相色谱法简便、灵敏、准确、重现性好，适用于分析非极性、弱极性或易挥发性成分；二者在萜类成分的含量测定方面应用广泛。近年来，GC-MS［12-13］和LC-MS［14-15］在烟草萜类成分分析中扮演着越来越重要的角色。通常，LC-MS 法不需要衍生化，但离子抑制（基质效应）明显，使方法灵敏度受到一定的影响；GC-MS/MS 法的选择性好、灵敏度高，且对复杂基质的抗干扰能力强［16］，因而在一些微/痕量萜类成分的分析中应用广泛。

目前，烟草萜类成分的含量研究中主要采用GC-MS 技术，研究对象主要是烤后烟叶、卷烟烟气等，而有关新鲜烟叶中萜类物质的含量研究较少，且往往局限于甾醇［17］、西柏烷二萜醇［18］等几种萜类成分，其他一些与烟草感官品质有关的重要二萜类成分如赖百当二萜类成分的研究鲜见报道，目标物的覆盖面较窄。研究新鲜烟叶中萜类成分的含量变化可以更准确地分析气候、海拔等生态因素对烟叶生长发育的影响，明确各个萜类成分在生育期的累积规律，能够为下一步关键调控机理和有效调控手段的研究奠定基础。基于此，建立新鲜烟叶中倍半萜、二萜、甾醇等21 种萜类成分的GC-MS/MS 检测方法，旨在为烟叶中多种萜类成分的准确定量分析提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

采摘河南、云南及贵州3 个省份12 个县市共9个烟草品种的成熟期第10 叶位烟叶，样品信息见表1。本批新鲜烟叶样品共72 份（烟叶样品品种及产区见表1，每份烟叶样品采用6 个生物学重复）。所有烟叶样品采摘后在液氮中速冻，并在干冰包埋下送至实验室中进行真空冷冻干燥，研磨成粉末后于-80 ℃保存备用。

表1 烟叶样品信息Tab.1 Information of tobacco samples

二氯甲烷（色谱纯，德国Merck 公司）；萜类标准 品 中（1S,2E,4S,6R,7E,11E）-2,7,11- 西 柏 烷 三烯-4,6-二醇、（1S,2E,4R,6R,7E,11E）-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、顺冷杉醇和赖百当-13-烯-8,15-二醇为实验室自制，经气相色谱-串联质谱检测（GC-MS/MS）检测，其纯度≥98%；其他标准品购自美国Sigma-Aldrich 公司。

Trace 1310GC 气相色谱仪（配AI 1310 自动进样器）、TSQ8000 质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.，美国Agilent 公司）；KQ-700DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；N-EVAPTM112 型氮吹仪（美国Organomation 公司）；BSA2245-CW 型电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）；MX-S 型漩涡混匀器（北京大龙兴创实验仪器有限公司）；5424 型台式高速离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

内标萃取液：以二氯甲烷为溶剂，配制质量浓度为2.5 mg·L-1的十三烷酸内标萃取液。

标准溶液：分别准确称取适量21 种萜类成分标准品，用内标萃取液溶解，稀释后配制成质量浓度为1 mg·L-1的标准储备液，于-80 ℃下保存备用。准确移取适量上述标准储备液，用内标萃取液稀释配制成系列质量浓度的混合标准溶液。

1.2.2 样品预处理与分析

准确称取新鲜烟叶冻干粉末20 mg 于2 mL 离心管中，加入1.5 mL 内标萃取液（含内标十三烷酸2.5 mg·L-1），涡旋6 s 后室温超声提取60 min；将提取液静置，并于120 000 r·min-1下离心12 min；取800 μL 上清液至1.5 mL 样品瓶中，用氮气吹干；加入200 μL 衍生化试剂（BSTFA/DMF，体积比1∶1）［19］，70 ℃下反应60 min；进样分析。GC-MS/MS 分析条件为：

进样方式：恒流模式，分流比20∶1；进样量：1.0 μL；进样口温度：280 ℃；载气及流速：氦气（99.999%），1.0 mL·min-1；升温程序：初始温度80 ℃，以20 ℃·min-1升至215 ℃，再以0.5 ℃·min-1升至220 ℃，最后以15 ℃·min-1升至310 ℃并保持15 min；电离方式：电子轰击（EI）；电离能量：70 eV；溶剂延迟：7 min；传输线温度：280 ℃；离子源温度：250 ℃；扫描方式：选择反应监测模式（Selective Reaction Monitoring，SRM）。21 种萜类成分及内标的质谱采集参数见表2。

1.2.3 数据分析

使用赛默飞世尔（Thermo Fisher Scientific）的Xcalibur 定量软件对烟叶中的各个萜类成分进行内标法和归一化法定量分析。采用SIMCA 15.0（Umetrics Sweden）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），利用t检验筛选差异性成分（P＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

二氯甲烷、氯仿和己烷能够与大部分萜类物质良好共溶，是萜类物质的优良提取溶剂［18,20-21］。甲醇、乙腈等对大部分的次生代谢产物如多酚、酯类化合物等具有良好的溶解性能。因此，本实验中分别考察了二氯甲烷、氯仿、正己烷、甲醇和乙腈对烟叶中萜类成分的提取效率，以目标物与内标峰面积之比进行比较，如图1 所示。由图1 可以看出，二氯甲烷的提取效果优于其他4 种溶剂，因此选择二氯甲烷作为提取溶剂。图2 为经二氯甲烷提取后烟叶中萜类成分的GC-MS 色谱图。由图2 可以看出，在优化条件下，烟叶中萜类成分的色谱分离效果较好。

表2 21 种萜类成分及内标的GC-MS/MS 分析的保留时间、特征离子及碰撞能量Tab.2 Retention time, quantitative and collision energies of 21 terpenoids and internal standard by GC-MS/MS

图1 不同提取试剂对21 种萜类成分检测结果的影响Fig.1 Effects of solvents on determination results of terpenoids

图2 新鲜烟叶萜类物质成分的TIC 图(以河南许昌产区的豫烟10 号样品为例)Fig.2 Total ion chromatogram of terpenoids in fresh tobacco (cv. Yuyan No.10 from Xuchang in Henan Province) detected by GC-MS/MS

2.2 方法验证

2.2.1 线性关系、检出限及定量限

取1.2 节所配制的系列混合标准品溶液10 μL，用氮气吹干，加入200 μL 衍生化试剂（BSTFA/DMF，体积比1 ∶1），70 ℃下反应60 min 后进行GC-MS/MS 分析。以各目标物定量离子色谱峰面积与内标定量离子色谱峰面积的比值对目标物浓度与内标浓度的比值进行线性回归分析，各目标物的线性回归方程及其决定系数见表3。可见，在一定的浓度范围内，各萜类标准品的质量浓度与相对峰面积具有良好的线性相关性，R2均大于0.999。

采用稀释混合标准溶液的方法测定每种萜类物质的检出限（以3 倍信噪比确定检出限）和定量限（以10 倍信噪比确定定量限），结果见表3。由表3 可知，各萜类标准品的检出限较低，为12.7～308.7 ng·mL-1。

2.2.2 方法重复性、仪器精密度及样品稳定性

准确称取6 份新鲜烟叶粉末样品进行平行处理，测定方法重复性；选择其中1 份试样连续进样8 针检测仪器的日内精密度，将该试样每天连续进样8 针并重复4 d 来检测仪器的日间精密度；另取1 份试样分别于衍生后0、12、24、48、72 h 进样，检测样品在常温条件下72 h 内的稳定性。结果见表4。可见，本方法呈现良好的重复性（RSD为0.92%～13.45%）和日内、日间精密度（RSD 分别为0.19%～8.28%、1.02%～9.35%）。此外，样品在72 h 内呈现较好的稳定性（RSD 为1.44%～10.72%）。

表3 21 种萜类化合物的标准曲线、决定系数、线性范围及检出限(LOD)、定量限(LOQ)Tab.3 Standard curves, determination coefficients, linear ranges, detection limits, quantitation limits of the 21 terpenoids

表4 GC-MS/MS 检测新鲜烟叶中21 种萜类成分的方法重复性、日内、日间精密度和样品稳定性Tab.4 Method repeatability, intra-day precision,inter-day precision and sample stabilities of the 21 terpenoids in fresh tobacco detected by GS-MS/MS

2.2.3 回收率

用新鲜烟叶粉末作为基质，选取高中低3 个浓度水平进行加标回收率实验，每个水平重复3 次，结果见表5。可以看出，21 种萜类物质的加标回收率在89.6%～118.7%之间，RSD 在0.19%～3.15%之间，说明本方法重复性好，准确度高。

2.3 实际样品分析结果

采用本方法对云南、河南及贵州3 个产区的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析，图3 为3 个产区新鲜烟叶中21 种萜类成分含量的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）得分图。由图3 可以看出，在萜类成分含量方面，3 个产区间具有明显的分离趋势，说明3 个产区间的萜类成分含量具有明显差异，且贵州产区的萜类成分含量分布较云南和河南产区差异更大，遵义产区的南江3 号烟叶中的萜类成分含量与其他3 个品种差异明显。

应用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对3 个产区烟叶中的萜类成分含量进行两两比较，并保留OPLS-DA 模型中VIP（Variable importance in the projection，变量重要性）值大于1 且非参数检验呈现显著差异（P＜0.05）的萜类成分，3 组结果取并集后得到3 个产区的差异成分。结果显示，α-CBD、角鲨烯、β-植醇、豆甾醇、胆固醇、菜油甾醇和β-谷甾醇是3 个产区的差异成分。α-CBD 是烟叶表面物质的主要成分，在调制、醇化以及燃烧过程中容易发生氧化降解产生多种降解产物如茄酮、茄醇和降茄二醇［4］等，并且与人体感官关系密切［22］。此外，α-CBD 与昆虫和微生物之间有互动性，具有较高的杀虫和杀菌活性［23］。由图4 可知，3 个产区烟叶中α-CBD 含量顺序为云南＞河南＞贵州，且相互之间均存在显著性差异。贵州产区中，南江3 号的α-CBD（13.35 μg·g-1）低于其他品种，与吴云平等［24］、朱显灵等［25］的研究结果一致，说明烟叶萜类成分差异可能由品种自身的遗传组成和生态因素综合决定。

表5 21 种萜类成分的加标回收率和相对标准偏差Tab.5 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 21 terpenoids （%）

图3 3 个产区的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图(R2X=0.261,R2Y=0.498,Q2=0.369)Fig.3 Partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)score scatter plot of three origins(R2X=0.261,R2Y=0.498,Q2=0.369)

图4 不同产区及品种之间的α-CBD 含量比较Fig.4 Comparison of content of α-CBD between different origins and different cultivars

3 结论

针对烟叶中存在的萜类物质，建立了基于GC-MS/MS 的定量分析方法，实现了烟叶中21 种萜类成分的快速检测及分析。在测定的质量浓度范围内工作曲线线性良好，方法的重复性、日内、日间精密度及稳定性较好；加标法测定的低中高水平线的回收率等均满足实验要求。采用此方法对云南、河南和贵州3 个产区的成熟新鲜烟叶进行了分析，除麦角甾醇外，其他20 种萜类均可稳定测得。其中，（1S,2E,4S,6R,7E,11E）-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、角鲨烯、β-植醇、豆甾醇、胆固醇、菜油甾醇和β-谷甾醇是3 个产区的差异成分，（1S,2E,4R,6R,7E,11E）-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇含量高低顺序为云南（98.83 μg·g-1）＞河南（57.04 μg·g-1）＞贵州（38.61 μg·g-1），且产区之间存在显著性差异。本方法适用于烟叶中萜类物质的测定。