超高效合相色谱-串联质谱手性分离和测定烟草及土壤中茚虫威对映体

杨 飞，李中皓，王 颖，刘珊珊，范子彦，边照阳，唐纲岭，邓惠敏

国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

目前，大约有30%的登记农药含有1 个或多个手性中心［1］。然而，由于生产技术和成本的原因，大多数手性农药仍以外消旋体的形式销售和使用。手性农药的对映体具有不同的生物活性、毒性及其他性质。通常，手性农药的活性只存在于1个或少数几个异构体中，而对生物活性无效或低效的异构体可视为农药中的“杂质”［2-3］。例如，2,4-滴丙酸的除草活性几乎全部集中在R-对映体上，其S-对映体几乎没有除草活性［4］。

茚虫威属于具有噁二嗪结构的氨基甲酸酯类高效杀虫剂，适用于防治甘蓝、辣椒、烟草等作物上的卷叶蛾类、菜青虫等。其分子结构中含有1 个手性中心，具有1 对对映体（图1）［5］。有研究表明，茚虫威的杀虫活性主要来源于S-异构体［6］。McCann 等［7］、李晓刚等［8］研究了茚虫威对映体在土壤中的选择性降解行为，发现土壤理化性质对茚虫威对映体的降解有很大的影响。在国际烟草科学研究合作中心（Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco，CORESTA）农用化学品咨询委员会（Agro-Chemical Advisory Committee，ACAC）制定的106 种农用化学品指导性残留限量表（Agrochemical Guidance Residue Levels，GRL）中，茚虫威（R-茚虫威和S-茚虫威之和）的残留限量被定为15 mg/kg［9］。

图1 茚虫威化学结构Fig.1 Chemical structure of indoxacarb

研究人员主要采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），以正相色谱模式对茚虫威进行手性分离和测定［10-13］。该方法需要消耗大量有毒有害的有机溶剂，而且分析时间较长。近年来，超临界流体色谱（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）引起了研究人员越来越多的关注［14-17］。与HPLC 相比，SFC 以低黏度二氧化碳为主要流动相，且允许使用更高的流速，从而获得更快的分离速度；同时，SFC 的有机溶剂消耗量低于HPLC。上述优点使SFC 在手性化合物的分析、测定和制备分离中得到了广泛应用。超高效合相色谱系统（Ultra Performance Convergence Chromatography，UPC2）是一种超高效超临界流体色谱，所用色谱柱的填料为亚2 μm 颗粒，与使用亚5 μm 颗粒的色谱柱相比，这种色谱柱具有更快的分离速度，而且超高效合相色谱与串联质谱（Tandem mass spectrometry，MS/MS）联用后可进一步提高方法灵敏度［18-22］。本研究中基于UPC2-MS/MS 开发了一种环境友好、灵敏快速的手性分析方法，对烟草及其土壤中的茚虫威对映体进行立体选择性拆分和测定，旨在为烟草农残分析提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

10 个烤烟样品，全部来自2018 年度国家烟草专卖局农残普查分析样品；10 个土壤样品，分别来自10 个烟叶样品对应的产地。所有样品烘干后粉碎，过2 mm（10 目）筛后置于棕色玻璃瓶中，于4 ℃下保存。

外消旋茚虫威（R-/S-茚虫威，质量分数均为50%，德国Augsburg 公司）；R-茚虫威（＞96.0%，天津阿尔塔科技有限公司）；乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇和甲酸（色谱纯，德国Merck 公司）；无水硫酸镁（MgSO4）、氯化钠（NaCl）、N-丙基乙二胺（PSA）（AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；高纯氮、高纯氩（＞99.99%，郑州源正科技发展有限公司）；水为超纯水。

ACQUITY 超高效合相色谱仪、ACQUITY TQD 四极杆串联质谱仪（配电喷雾电离源）、Acquity UPC2Trefoil CEL1 和Acquity UPC2Trefoil CEL2 柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）（美国Waters公 司）；Chiralcel OD-3 和Chiralcel IG-3 柱（100 mm×3.0 mm, 3.0 μm）（日本Daicel 公司）；VX200涡旋振荡仪（美国Labnet 公司）；SG3-30K 高速离心机（德国Sigma 公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；AEl63 电子天平（感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基质匹配标准工作溶液的配制

称取20 mg 茚虫威外消旋体标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，制得R-茚虫威和S-茚虫威质量浓度均为100 μg/mL 的一级混合标准储备液。移取1.0 mL 一级混合标准储备液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，得到R-茚虫威和S-茚虫威质量浓度均为10 μg/mL 二级混合标准储备液。分别移取二级混合标准储备液1 000、500、200、100和50 μL 至5 个10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，制得不同质量浓度的标准工作溶液。分别移取0.2 mL 标准工作溶液和0.2 mL 空白样品提取液，混合后用乙腈稀释至1 mL。各基质匹配标准工作溶液中对映体的质量浓度分别为200、100、40、20 和10 ng/mL。所有溶液避光储存在-20 ℃的冰箱中。

1.2.2 样品前处理及分析

参考本课题组前期的研究［23］对样品进行前处理，简述如下：称取2 g 样品置于具盖离心管中，加入超纯水和乙腈，涡旋振荡；向离心管中加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，继续涡旋振荡；移取1 mL 上清液于1.5 mL 离心管中，加入无水硫酸镁及PSA，涡旋振荡；取上清液，用0.22 μm 有机相滤膜过滤；取200 μL 滤液，加入800 μL乙腈，混匀后进行UPC2-MS/MS检测。UPC2-MS/MS 分析条件为：

色谱柱：Chiralcel IG-3 柱（100 mm×3 mm，3.0 μm）；动态背压：13.79 MPa；柱温：35 ℃；样品室温度：10 ℃；补偿溶剂：0.1%甲酸的甲醇溶液，流速0.2 mL/min；进样量：2 μL；流动相流速：2.0 mL/min；流动相：A 相为CO2，B 相为甲醇；等度洗脱：流动相A∶流动相B=92%∶8%；质谱扫描方式：正离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥空气流量：60 L/h；停留时间：100 ms；毛细管电压：4.5 kV；采集模式：多反应监测（MRM）；定量离子对（m/z）：527.97＞149.95（锥孔电压：38 V，碰撞电压：20 V）；定性离子对（m/z）：527.97＞202.97（锥孔电压：38 V，碰撞电压：38 V）。

1.2.3 加标样品制备

在优化的条件下，对实际样品进行分析。各选取1 个烟叶样品和土壤样品作为空白样品。向空白样品中添加不同量的外消旋体标准储备液，得到3 个不同浓度的空白加标样品，其中R-/S-茚虫威对映体的含量分别为2.5、7.5、15.0 mg/kg。在样品中加入10 mL 甲醇并涡旋振荡10 min，混匀后置于通风橱中在室温下挥干溶剂。加标样品按照1.2.2 节方法处理，每个浓度水平重复测定5 次，连续测定3 d，采用基质匹配标准工作曲线进行定量分析。

1.2.4 数据分析

数据采集采用MassLynx V4.1 软件。平均值、回收率和相对标准偏差（RSD）的计算采用Microsoft Excel 2007 版软件。

2 结果与讨论

2.1 手性分离条件的优化

2.1.1 手性柱的选择

分别考察了Acquity UPC2Trefoil CEL1、Acquity UPC2Trefoil CEL2、Chiralcel OD-3 和Chiralcel IG-3 等4 种不同的手性柱对茚虫威两种对映体的分离情况。Acquity UPC2Trefoil CEL1 和Acquity UPC2Trefoil CEL2 柱均使用改性的多聚糖型固定相，其中Acquity UPC2Trefoil CEL1 柱的硅胶表面涂敷有纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯），Acquity UPC2Trefoil CEL2 柱的硅胶表面涂敷有纤维素-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）。Chiralcel OD 柱为多糖衍生物正相涂敷型手性色谱柱，硅胶表面涂敷有纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）。Chiralcel IG-3 柱为多糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱，硅胶表面以共价键键合有直链淀粉-三（3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯）。实验结果（图2）表明：当使用Acquity UPC2Trefoil CEL1 和Chiralcel OD-3 柱时，不能实现茚虫威对映体的完全分离；使用Acquity UPC2Trefoil CEL2 和Chiralcel IG-3 柱均可实现对映体的分离，但使用Acquity UPC2Trefoil CEL2 柱时，目标物色谱峰信号明显减弱。综合考虑目标物分离度及色谱峰形和响应情况，选择Chiralcel IG-3 柱对茚虫威对映体进行分离。

图2 4 种不同色谱柱上茚虫威对映体的UPC2-MS/MS 色谱图Fig.2 Typical UPC2-MS/MS chromatograms of indoxacarb on four different columns

2.1.2 改性剂的确定

超高效合相色谱以超临界CO2流体为流动相，通常需在超临界流体中添加少量的有机溶剂（甲醇、乙醇、异丙醇）作为改性剂。改性剂可以改变流动相的洗脱强度，并降低流动相与固定相的硅烷醇基团的相互作用，从而改善色谱峰形［24］。考察了3 种有机改性剂（甲醇、乙醇和异丙醇）对茚虫威对映体在Chiralcel IG-3 柱上分离效果的影响。结果（图3）表明，使用甲醇、乙醇和异丙醇均可以实现茚虫威对映体的基线分离，但当使用乙醇和异丙醇时，茚虫威对映体的MS 信号明显减弱且保留时间变长。实验中还考察了甲酸、乙酸和甲酸铵对茚虫威对映体拆分的影响，结果表明，加入甲酸、乙酸等并没有改善对映体之间的分离度和信号响应强度。因此，选择甲醇作为流动相改性剂。

图3 改性剂对茚虫威对映体分离效果的影响Fig.3 Effect of modifier solvent on enantioseparation of indoxacarb enantiomers

2.1.3 动态背压的选择

动态背压（Automatic back pressure regulator，ABPR）升高后，流动相密度随之增加，而目标物的保留时间减小。原因可能是，在高背压下色谱柱内流动相密度增加，溶剂化能力和洗脱效率均有所提高［25］。分别考察了不同背压（11.03、12.41、13.79 和15.17 MPa）对茚虫威对映体分离效果的影响。结果（图4）显示，随着动态背压的升高，目标物保留时间减少，但是动态背压对目标物分离效率无显著影响，茚虫威对映体的分离度几乎不变。可见，动态背压变化在茚虫威对映体的分离中不起关键作用。当动态背压为13.79 MPa 时，茚虫威对映体的色谱峰信号响应强度较高。因此，选择动态背压为13.79 MPa。

图4 动态背压对茚虫威对映体分离效果的影响Fig.4 Effect of ABPR on enantioseparation of indoxacarb enantiomers

2.1.4 柱温的确定

对于合相色谱，温度也会影响目标物的保留时间。随着柱温的升高，二氧化碳的密度和黏度降低，对目标物的洗脱能力降低，从而导致目标物保留时间延长［26-27］。在动态背压13.79 MPa、流速2 mL/min 的条件下，考察了不同柱温（35～50 ℃）对茚虫威对映体拆分效果的影响。结果（图5）表明，随着柱温的升高，目标物保留时间增加，但对映体分离度几乎不变；在柱温35 ℃时，茚虫威对映体的色谱峰面积最大，方法灵敏度较高。因此选择柱温为35 ℃。

图5 柱温对茚虫威对映体分离效果的影响Fig.5 Effect of column temperature on enantioseparation of indoxacarb enantiomers

2.1.5 茚虫威对映体的洗脱顺序

在优化的条件下，利用R-茚虫威标准溶液确定茚虫威两种异构体在UPC2-MS/MS 分析中的洗脱顺序。实验中，根据先前的研究报道［5］鉴定了茚虫威对映体的旋光性。结果显示，茚虫威对映体在手性柱（Chiralcel IG-3）上的洗脱顺序为：S-（+）-茚虫威（1.05 min）和R-（-）-茚虫威（1.28 min）。在优化的手性分离条件下，烟草和土壤实际加标样品的选择离子色谱图如图6 所示。可以看出，在不同的基质中，S-茚虫威和R-茚虫威均实现了基线分离，且峰形良好。

2.2 方法评价

图6 烤烟和土壤实际加标样品的色谱图Fig.6 Chromatogram of actual spiked samples of flue-cured tobacco and soil

2.2.1 基质效应一般认为，液质联用中的基质效应是由于基质成分和目标物在离子化时相互竞争造成的，表现为离子抑制或离子增强效应，其对仪器的灵敏度和重复性影响显著［28］。通常采用基质标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率之比（K）来评价基质效应：当K 在0.9～1.1 之间时，基质效应不明显；当K大于1.1 时为基质增强效应；当K 小于0.9 时为基质减弱效应。结果（表1）表明，在基质不稀释的情况下，基质效应在0.15～0.39 范围内，说明在烟草和土壤基质中存在显著的基质抑制效应。因此，对于烟草和土壤样品中茚虫威对映体的测定，均使用基质匹配标准溶液进行定量分析。

基质的稀释倍数也是影响基质效应的重要因素。实验中考察了不同稀释倍数下烤烟和土壤样品中茚虫威对映体的基质效应。结果（表1）表明，随着稀释倍数的增加，目标物的相对响应强度（各样品的响应强度与标样的响应强度之比）也增大，表明稀释样品有助于减小基质效应。但是稀释的作用有限，稀释倍数过高，则目标物浓度太低，从而影响方法灵敏度。因此，选择用乙腈将其稀释5倍后进样。

表1 茚虫威对映体的线性方程、基质效应、检出限和定量限Tab.1 Regression equation, matrix effect, LODs, and LOQs for enantiomers of indoxacarb

2.2.2 标准曲线、检出限和定量限

通过绘制茚虫威对映体色谱峰面积与其浓度的关系图来生成标准曲线。标准曲线的形式为Y = AX + B，其中A 和B 分别表示为斜率和截距。对于每种对映体，在10～200 ng /mL 的质量浓度范围内分析标准工作溶液和不同基质匹配的标准工作溶液，以确定该方法曲线的线性。表1 表明，不同基质中各对映体线性关系良好（R2＞0.993），可以满足定量分析的需要。将加标空白烟草和土壤提取物中产生的信噪比（S/N）等于3 和10 时对映体的浓度分别定义为检出限（LOD）和定量限（LOQ）。由表1 可知，不同基质中LOD 和LOQ 分别为0.028～0.048 和0.088～0.148 mg/kg。

2.2.3 方法回收率及精密度

通过空白样品加标回收实验来测试该方法的准确度和精密度。制备了3 个不同浓度的加标样品，按照1.2.2 节的方法进行前处理，每个浓度的样品每天重复测定5 次，连续测定3 d。3 个不同浓度的加标样品中R-茚虫威和S-茚虫威的含量为2.5、7.5 和15.0 mg/kg。该方法的精密度由重复性实验确定，并以RSD 表示。通过比较同一天内加标样品的回收率的标准偏差来测量日内精密度。通过分析3 个不同日期的加标样品来确定日间精密度。结果（表2）显示，在所有浓度水平下均获得较好的平均回收率（83.7%～96.6%），两种对映体的日内精密度（RSD）为2.4%～6.1%，日间精密度（RSD）为3.3%～5.8%。

2.3 方法的应用

采用本方法对10 个烤烟样品和10 个土壤样品进行了测定，结果显示：仅有1 个土壤样品检出有R-茚虫威和S-茚虫威，含量分别为1.05 和0.88 mg/kg，远远低于GRL中规定的茚虫威对映体的残留限量［9］。该研究结果也与烟草中农药实际使用情况相吻合。氨基甲酸酯类农药在烟草中的使用量很小，多年来烟草中该农药的检出率一直保持在很低的水平。个别土壤样品检出茚虫威可能是由于轮作所致。另外，由于茚虫威对映体的降解速率不同，因此，两种茚虫威对映体的含量存在差异。

表2 方法的精密度和准确度Tab.2 Accuracy and precision of the proposed method

3 结论

建立了手性分离和测定烟草和土壤样品中茚虫威对映体的超高效合相色谱-串联质谱方法，采用本方法可在5 min 内实现茚虫威对映体的基线分离。在优化的实验条件下，茚虫威对映体的回收率在83.7%～96.6%之间，日内精密度为2.4%～6.1%，日间精密度为3.3%～5.8%。本方法以CO2作为主要流动相，定量结果较为准确可靠。本研究为烟草及土壤中茚虫威对映体的分离和测定提供了一种绿色、快速、可靠的方法。