不同浓度硒对烟草根系形态、生长素含量及相关基因表达的影响

罗 勇，刘胜波，张 涛，王立志，轩栋栋，徐涤寒，邵惠芳，贾宏昉*

1. 河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95 号450002

2. 史丹利化肥宁陵有限公司，河南省商丘市宁陵县露岭路 476000

3. 浙江中烟工业有限责任公司，杭州市上城区中山南路77 号 310000

硒是一种重要的营养元素。大量研究表明硒对植物生长具有双重效应，适量的硒可以增强抗氧化能力，延缓衰老，促进植物生长［1-2］。一般认为，硒在低浓度(0.001～0.05 mg/kg)时对植物的生长发育有促进效应，高浓度则起到抑制作用，甚至产生毒害［3］。Han 等［4］报道，低浓度硒（2.2 mg/kg）可促进烟草生长，根系生物量提高10.3%；高浓度硒（11.1 mg/kg）则抑制植物生长，根系生物量仅为对照处理的70.5%。高家合等［5］研究表明，施用适量硒不仅能提高根系活力，促进烟草生长, 还提高了烟叶品质和卷烟的安全性。贾宏昉［6］研究提出，叶片喷施适量的硒可显著增加烤烟全氮含量、降低总糖含量，有利于改善烤烟品质。王美珠等［7］发现烟叶硒含量的增加可导致卷烟焦油量和自由基浓度降低, 使人体的血硒水平通过抽吸富硒卷烟而得到提高。可见，叶片喷施适量硒可提高烤烟的产量、品质以及安全性。硒对植物的生长发育的作用机制研究主要集中在抗氧化作用上，而对激素在这个过程中所起的作用研究较少。生长素是调节植物根系发育的一种关键激素，参与胁迫反应中根系构型的变化［8-10］，从而有助于植物体从地下吸收营养物质到茎秆部，促进植物的生长发育［11］。Lehotai等［12］报道，施用高浓度Se（40 μmol/L）可抑制拟南芥主根伸长并降低生物量。进一步的研究表明，高浓度硒可以降低根尖生长素浓度，但低浓度硒是否可以通过改变生长素含量而促进植物生长发育尚鲜见报道。因此，以能标记生长素的DR5::GUS 云烟87 转基因烟草为材料，研究不同浓度硒处理对烟草生物学性状、生长素、MDA 含量及NtYUCCA 和NtPINs 基因家族表达的影响，揭示不同浓度硒对烟草生长发育的作用，旨在为富硒烟草栽培技术和烟叶的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2017—2018 年在河南农业大学文化路校区实验室的人工培养箱内进行，光强300 μmol·m-2·s-1，28 ℃/16 h 昼，24 ℃/8 h 夜。供试材料为DR5::GUS 云烟87 转基因纯合株系（该转基因材料仅用于室内试验，以便于标记生长素），DR5 是一个人工合成的响应生长素的启动子。挑选饱满光洁无菌斑的种子经过75%的酒精消毒30 s，10%次氯酸钠消毒7 min,灭菌蒸馏水冲洗5 次，放在MS培养基上育苗，并放入28 ℃暗室培养3 d 催芽。催芽后的种子放入光照培养箱培养1 周，选取长势较为一致的幼苗移至MS 培养基的组培瓶中，进行21 d 的营养处理。硒以Na2SeO3加入配置的MS培养基中，硒浓度为0、1、5、10 和20 mg/L，分别以Se0、Se1、Se5、Se10、Se20 表示。每处理设置3 次重复，每重复10 株烟苗。

1.2 样品采集与分析

根系形态的测定：每重复取3株长势一致的烟苗（处理21 d），用去离子水冲洗根系，拍照，再用根系扫描仪［型号：Expression 11000xl，爱普生（中国）有限公司］测定不定根长度，人工测定二级根长度和数量。

生物量的测定：每重复取3 株长势一致的烟苗（处理21 d），分地上部和地下部用天平（感量0.001 g）称量，并记录样品鲜质量。

生长素的测定：每重复取3 株长势一致的烟苗（处理21 d），分地上部和地下部，鲜样于-70 ℃冷冻保存。采用酶联免疫法(ELISA)［13］测定烟株中生长素含量（质量分数）。IAA 标准品购自Sigma-Aldrich 公司。

NBT 染色与MDA 含量的测定：每重复取5 株长势一致的烟苗（处理7 d），用清水冲洗干净，浸没于NBT 染液中，30 ℃染色5 h。待染色完成后将叶片分别放入75%乙醇、95%乙醇中直至材料脱色完全，用Olympus SZX16 体式显微镜（日本奥林巴斯公司）观察并照相。参照Feng 等［14］的方法测定MDA 含量（质量分数）。

GUS 组织染色和活性测定：每重复取5 株长势一致的烟苗（处理21 d），将烟苗整株浸没于GUS染液中，37 ℃染色24 h。待染色完成后将烟苗分别放入75%乙醇、95%乙醇中直至材料脱色完全，在OlympusSZX16 体式显微镜下观察并拍照。参照李依婷［15］的方法进行GUS 活性测定。使用牛血清白蛋白作为标准物，用Bio-Rad 蛋白质测定试剂盒（美国伯乐公司）测定蛋白质含量（质量分数）。

NtYUCCA 和NtPINs 基因家族的表达：烟苗处理21 d 后，对0、1 和10 mg/L 硒处理的烟苗整株取样（每重复分别取10 株长势一致的烟苗），参照王立志等［16］的方法进行qRT-PCR 分析。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，新复极差法进行差异的显著性比较。采用Olympus SZX16体式显微镜、Adobe Photoshop 和Microsoft Excel 2010 软件分别进行染色拍照、图像处理和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同浓度硒处理烟草表型及生物量的变化

与对照（Se0）相比(图1A)，低浓度硒（Se1）处理烟苗根系发育较好，主根明显伸长，高浓度硒（Se5、Se10、Se20）处理植株矮小，叶片小而少。与对照（Se0）相比（图1B、C），烟苗地上部和地下部（根系）生物量分别显著增加76.9%和105.9%；高浓度硒处理（Se5、Se10、Se20）的烟苗地上部与地下部生物量与对照相比，分别显著减少36.9%、60.8%、70.8%和39.8%、64.0%、73.8%。适宜的硒浓度显著增加烟苗主根根长和侧根数，特别是Se1 处理，主根根长和侧根数分别是对照（Se0）的2.1 倍和2.0 倍（图1D、E）。表明硒处理可以改变烟苗的根系结构，低浓度硒（1 mg/L）能够促进烟苗根系的生长发育，高浓度硒（5、10、20 mg/L）则起到抑制作用。

2.2 不同浓度硒处理对烟草生长素含量的影响

5 个处理烟苗地上部和地下部生长素含量见图2。与对照（Se0）相比，低浓度硒处理的烟苗（Se1）地上部生长素含量增加13.6%，地下部生长素含量增加37.1%；高浓度硒处理（Se5、Se10、Se20）的烟苗地上部和地下部生长素含量均显著降低，其中烟苗地上部含量分别降低4.3%、32.6%和55.4%，而烟苗地下部生长素含量分别降低10.7%、21.7%和34.2%。烟苗地上部和地下部生长素含量随着硒用量的增加而降低。

2.3 不同浓度硒处理对烟草抗氧化能力的影响

膜脂过氧化产物MDA 含量见图3。与对照（Se0）相比（图3A），低浓度硒处理（Se1）的烟苗新叶颜色较浅，说明活性氧量较少，抗氧化能力强，高浓度硒处理（Se10）的新叶颜色深，活性氧量较多，抗氧化能力弱。与对照相比（图3B），低浓度硒处理（Se1）的烟苗MDA 含量下降39.8%，高浓度硒处理（Se10）MDA 含量则上升44.4%。说明低浓度硒处理有利于降低MDA 含量，缓解氧化胁迫，对烟草细胞膜有一定保护作用，高浓度硒则促进MDA 的生成，加剧氧化胁迫，进而促进了细胞膜脂质过氧化。

图1 不同浓度硒处理烟苗生物量统计及根系表型比较Fig.1 Biomass statistics and root phenotype of tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

图2 不同浓度硒处理烟苗生长素含量比较Fig.2 Auxin contents in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

图3 不同浓度硒处理烟苗叶色及MDA 含量比较Fig.3 MDA contents in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

2.4 不同浓度硒处理对烟草生长素分布的影响

烟苗中DR5::GUS 的染色情况和GUS 活性见图4。与对照（Se0）相比（图4A），低浓度硒处理（Se1）烟苗新叶、侧根根原基和距根尖1～2 cm 处的DR5::GUS 颜色较深，烟苗生长素在根系分布较多；高浓度硒处理（Se10）则颜色较浅，烟苗生长素在根系分布较少；与对照(Se0)相比（图4B、C），低浓度硒处理（Se1）的烟苗地上部和地下部GUS 活性分别提高34.1%和40.1%，高浓度硒处理（Se10）的烟苗地上部和地下部GUS 活性则分别下降65.5%和67.6%。这表明低浓度硒处理DR5 启动子表达水平增强，高浓度硒则会抑制启动子表达，这与染色的结果一致。

2.5 不同浓度硒处理对烟草根系中NtYUCCA 和NtPINs 基因家族表达的影响

烟苗根系中NtYUCCA 基因家族和生长素极性运输蛋白NtPINs 基因家族的表达见图5。除NtYUCCA3、NtYUCCA10 和NtPIN2、NtPIN3、NtPIN11的表达水平较低没有统计学意义外，低浓度硒处理（Se1）的 烟 苗 根 系 中NtYUCCA4、NtYUCCA6、NtYUCCA8 和NtYUCCA9 的基因表达水平分别增加87.2% 、521.3% 、725.2% 和248.3% ，NtPIN1a、NtPIN1c、NtPIN4 和NtPIN9 的基因表达水平分别增加91.1%、186.1%、35.4%和28.5%。高浓度硒处理（Se10）的 烟 苗 根 系 中NtYUCCA4、NtYUCCA6、NtYUCCA8 和NtYUCCA9 的基因表达水平分别降低62.8%、22.7%、47.9%和16.8%，NtPIN1a、NtPIN1c、NtPIN4 和NtPIN9 基因表达水平分别降低44.9%、22.8%、12.8%和14.7%。这表明低浓度硒处理可促进生长素合成和极性运输，高浓度硒处理则起到抑制作用。

图4 不同浓度硒处理烟苗各部位生长素分布和GUS活性比较Fig.4 Auxin distribution and GUS activity in different parts of tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

图5 不同浓度硒处理烟苗中NtYUCCA 和NtPINs 基因家族相对表达量比较Fig.5 Relative expressions of NtYUCCA and NtPINs gene families in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

3 讨论

植物根系形态对植物体从土壤中吸收养分有较大影响［17］。在本试验中，低浓度硒（1 mg/L）处理可显著促进烟株生长，高浓度硒(10 mg/L)处理则对烟株生长发育产生抑制作用。这与Ramos 等［18］在生菜上和Yao 等［19］在小麦上的试验结果一致。付冬冬等［20］在对不同硒处理的小白菜研究中提出，低浓度硒处理可促进小白菜的生长,而高浓度硒处理则起到抑制作用。但本试验结果与Lyons 等［21］和周鑫斌等［22］的研究结果存在差异。Lyons 等［21］认为低浓度亚硒酸盐对小麦的生长虽有促进作用，但效果没有达到显著水平；周鑫斌等［22］提出8 mg/L 以下的亚硒酸盐浓度不会显著提高水稻的生物量。可能是因为不同作物类型对硒的吸收与品种、pH、离子环境等因素有关，其有效浓度可能存在较大差异［23］，但总体趋势为低浓度硒处理表现为促进作用，高浓度硒处理则表现为抑制作用。

本试验中，低浓度硒处理烟株活性氧量减少，MDA 含量降低，而高浓度硒处理则活性氧量增加，MDA 含量提高。Cartes 等［24］研究提出，当加入的硒浓度≥6.0 mg/kg 时，黑麦草中MDA 含量增加，反之则减少。Feng 等［25］研究表明，当硒浓度≤2.0 mg/L 时，蜈蚣草中MDA 含量减少，反之则增加。MDA 是植物在逆境条件下的膜脂过氧化反应产物之一，能直接反映膜受损和膜脂过氧化程度。植物在发生硒毒害的情况下，对营养元素的吸收会减少［26］，植物体内Ca 可以抵抗逆境带来的损伤，参与多种酶活性的调节［27］，保护细胞膜的完整性［28］。有研究表明，低浓度硒（2.2 mg/L）处理可以促使烤烟对Ca 元素的吸收，高浓度硒(22.2 mg/kg）处理烤烟各部位钙含量均低于低浓度硒处理［29］。Mg 也有与Ca 相似的功能［30］。由此推测，烟株对Ca 和Mg 等元素的吸收，可能抑制了高浓度硒的毒害作用，其作用机制还有待进一步深入研究。

生长素参与植物生长发育的调控［31-32］。在本试验中，利用DR5::GUS 转基因材料GUS 报告基因表达与生长素分布积累部位一致的特性［33-35］，可直观描述不同浓度硒处理对烟草生长素分布的影响。前人研究表明，磷参与调节植物体内的生长素合成和极性运输，从而影响根系的构型［36］。缺磷可增加根系生长素含量，促进根系生长，提高根冠比［37］。最新研究发现，亚硒酸盐和磷酸盐具有相似的吸收机制，磷转运蛋白OsPT8 参与植物对亚硒酸盐的吸收［38］，推测硒可能通过与磷互作从而改变生长素的浓度来影响植物生长和发育。而有关硒和磷互作条件下添加外源生长素对烟苗生长发育的影响，以及磷硒互作对烟草生长发育的作用机制尚需进一步试验。

不仅生长素，其他内源激素（细胞分裂素、乙烯、赤霉素）等对植物根系发育也可能有一定影响。有研究表明，高浓度硒处理通过活性氧的积累、植物激素的变化等复杂组合方式而抑制根系生长［39］。Lehotai 等［12］利用拟南芥研究了亚硒酸盐诱导的应激过程中激素（生长素、细胞分裂素、乙烯）和信号组分（NO 和H2O2）间可能的作用和关系。提出高浓度亚硒酸盐诱导的乙烯生物合成增强可能导致植株细胞死亡，引起植物生长障碍；同时，较高Se 浓度（20、40 μmol/L）处理可抑制蛋白质的合成，增加活性氧的积累，影响植物根系的发育。因此，不同浓度硒处理下细胞分裂素、乙烯、赤霉素等激素在烟株根系发育过程中的作用及机制还需要进一步深入研究。

4 结论

在人工培养箱（光强300 μmol·m-2·s-1，28 ℃/16 h 昼，24 ℃/8 h 夜）中，通过改变培养基硒浓度（0、1、5、10 和20 mg/L）研究了烟草幼苗对不同浓度硒处理的响应。硒对烟草的生长发育具有双重效应。低浓度硒（1 mg/L）处理条件下, 生长素合成NtYUCCA 基因家族与生长素极性运输蛋白NtPINs 基因家族的表达水平提高，生长素的合成以及地上部向根部的极性运输明显增加，根系生长素含量提高，从而促进烟草生物量显著增加，并改变了烟草根系构型（主根伸长，侧根数量多），MDA 含量降低，抗氧化能力增强，促进了烟草的生长发育；高浓度硒（10 mg/L）处理条件下，生长素合成以及地上部向根部的极性运输被抑制，生长素含量降低，烟草的生长发育受到抑制。