毛细管电泳技术检测羊乳婴幼儿配方粉中的牛乳成分

刘鸣畅 侯艳梅 杨艳歌 黄文胜 陈 颖 吴亚君*

（1中国检验检疫科学研究院 北京 100176

2海普诺凯营养品有限公司 长沙 410005）

随着食品工业的发展和生活水平的提高，以羊乳为代表的高值小众乳品发展迅速，丰富了消费者的选择。羊乳脂肪颗小，更易于被人体吸收[1-3]，并且羊乳的酪蛋白组成与人乳相近，致敏性较低[4-5]，适合作为婴幼儿配方粉原料。然而，羊乳产品掺杂牛乳成分的现象比较普遍，给乳品市场带来较大干扰[6-7]。为了规范产业发展，保护消费者权益，有必要建立准确、快速的检测方法，以确保乳源真实性。目前文献报道的有关乳源成分检测的方法包括DNA检测[8-9]、理化分析（酸度测定、色谱）[10-14]、酶联免疫检测[15]等，不同方法应用范围不同，各有优缺点。例如：DNA检测可准确鉴别各种动物来源，然而受辅料影响，容易产生假阳性结果。酶联免疫技术操作简便，然而受抗体来源和交叉反应性限制。一些理化分析指标不足以区分乳源。

蛋白质是乳品最主要的营养成分，是乳品检测最重要的指标。乳蛋白主要分为乳清蛋白和乳酪蛋白，乳清蛋白以α-乳白蛋白、β-乳球蛋白为主，乳酪蛋白含量约为总蛋白的80%，主要以α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白为主。有研究表明，牛乳和羊乳蛋白种类虽基本相同，但含量存在差异[16]。SDS-PAGE被广泛用于蛋白质组分的分析，可以很好地揭示蛋白质多肽组成在分子质量上的差异，这种分子质量的差异可以是多肽氨基酸构成的差异，也可以是翻译后修饰或产品在加工储存过程中修饰的结果，均可作为不同产品蛋白质组成差异的指标。相比于传统的垂直板电泳技术，毛细管凝胶电泳技术同样基于SDS-PAGE的原理，操作简便，自动化，易量化和标准化，近年来在食品分析领域得到越来越广泛的应用，已出现在我国、欧洲、美国的药典以及ISO和IDF等多个标准中[17-18]。例如Ding等[19]采用毛细管电泳法定量检测α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，并对乳清蛋白粉、牛初乳、不同处理工艺及保质期的液态奶、酸奶、不同阶段婴幼儿配方奶等乳品进行分析。笔者采用该技术建立掺假燕窝中银耳蛋白成分的检测方法[20]、蜂王浆新鲜度标志蛋白的检测[21]以及牛乳中外源蛋白成分检测方法[22]，证实毛细管电泳方法可作为食品真实属性识别以及品质分析的重要手段。

本研究采用毛细管凝胶电泳技术，通过筛选酪蛋白标志峰，初步建立羊乳中牛乳成分检测方法。考察该方法在分辨率、灵敏度、稳定性等方面的参数，以及对市售样品的检测情况，初步验证毛细管凝胶电泳技术作为乳品乳源真实性检测方法具有很好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品 婴幼儿配方羊乳粉、全脂羊乳粉、脱脂羊乳粉、绵羊乳清粉、山羊乳清粉、牛乳清粉、牛乳糖，均由海普诺凯公司提供；市售牛乳配方粉样品、液态牛乳以及液态羊乳品，北京某超市；脱脂牛乳粉，美国Bio-Rad。

1.1.2 主要试剂 毛细管电泳仪SDS-MW试剂盒、分子量标准品，美国 AB sciex；DTT、30%丙烯酰胺溶液、TEMED，美国 Bio-Rad；无 EDTA蛋白酶抑制剂，德国Roche。

1.1.3 主要仪器与设备 PA800 plus毛细管电泳仪及光电二极管阵列 （PDA）检测器，美国AB sciex；电子天平，Sartorius公司；5418R冷冻离心机，德国 Eppendorf；微量移液器，德国Eppendorf；涡旋振荡器，Genie公司；垂直板电泳系统，美国Bio-Rad；Thermomixer comfort舒适型恒温混匀仪，德国Eppendorf；HH-1数显恒温水浴锅，中国金坛市白塔新宝仪器厂。

1.2 毛细管凝胶电泳方法

称取500 mg乳粉样品于15 mL离心管中，加2%SDS样品缓冲液7 mL，涡旋震荡至充分溶解。用移液枪取样品10 μL，加85 μL SDS样品缓冲液、1 μL 10 ku 内标蛋白溶液和 5 μL β-巯基乙醇，盖紧瓶盖并充分混合，于沸水浴中加热3 min，进样前将样品瓶置于室温水浴中冷却5 min，上样进行电泳分析。毛细管柱为50 μm×30.2 cm非涂层石英毛细管。

图1 羊乳婴幼儿配方粉样品以及其生产原料毛细管凝胶电泳图谱Fig.1 CGE maps of goat infant formula and the materials

电泳步骤：50 psi（344 737.85 Pa）条件下0.1 mol/L NaOH碱洗 5 min，50 psi条件下 0.1 mol/L HCl酸洗 2 min，50 psi条件下去离子水冲洗 2 min，40 psi（275 790.28 Pa）条件下 SDS 凝胶灌注10 min，5.0 kV电压上样20 s，5.0 kV电压分离30 min，采用检测器为光电二极管阵列（PDA）检测器，在4℃条件下检测，获取数据。

2 试验结果

2.1 牛乳蛋白特征峰的筛选

婴幼儿配方粉主要是由全脂乳粉、脱脂乳粉、乳清粉、乳糖以及油脂、维生素、矿质元素等营养素调配而成，作者收集了真实来源的羊乳婴幼儿配方粉和全脂羊乳粉、脱脂羊乳粉、绵羊乳清粉、山羊乳清粉、牛乳糖等物料，以及牛乳清粉和牛乳婴幼儿配方粉。采用优化后的毛细管凝胶电泳方法分析样品的蛋白质组分，结果如图1所示。牛乳婴幼儿配方粉的酪蛋白区比羊乳婴幼儿配方粉多了一个特征蛋白峰C1。在羊乳婴幼儿配方粉的物料样品以及全脂羊乳粉、脱脂羊乳粉、绵羊乳清粉、山羊乳清粉、牛乳糖中均未检测到C1蛋白峰。C1蛋白峰是牛乳酪蛋白的特征峰，其迁移时间与牛乳β-酪蛋白相同，初步判定β-酪蛋白，可作为牛乳乳源的特征标志物。

为验证C1蛋白峰普遍存在于牛乳婴幼儿配方粉中，从市场上收集不同来源的8种牛乳婴幼儿配方粉进行毛细管凝胶电泳分析，结果如图2所示。在不同来源牛乳婴幼儿配方粉中，C1蛋白峰稳定存在，迁移时间一致。

图2 8个市售牛乳婴幼儿配方粉毛细管凝胶电泳图谱Fig.2 CGE maps of 8 commercialized cow infant formulas

2.2 方法稳定性及重复性

2.2.1 方法稳定性 为考察所建立的毛细管电泳方法对蛋白组分分析的重复性，将毛细管电泳分子质量标志蛋白按照标准操作程序处理，如图3所示，单次试验连续进样6次。表1是6次进样的每个蛋白峰的迁移时间与10 ku蛋白内标迁移时间的差值和相对标准偏差。结果显示相对标准偏差均低于1%。

2.2.2 方法重复性 将蛋白按照标准操作程序进行处理，做6次独立试验。表2是6次独立重复试验的每个蛋白峰的迁移时间与10 ku蛋白迁移时间的差值和相对标准偏差。相对标准偏差均低于1%。

图3 分子质量标准品毛细管电泳图谱Fig.3 CGE maps of sizing standard

表1 6次进样分子质量标准品与10ku内标迁移时间的差值Table1 The difference of migration time between 6 injection of sizing standard and 10 ku internal standard

表2 6次独立重复试验分子质量标准品与10ku内标迁移时间的差值Table2 The difference of migration time between 6 independent repetitive tests of sizing standard and 10 ku internal standard

2.3 线性关系及灵敏度

为了考察标志蛋白峰C1与牛乳含量之间的数量关系，将羊乳婴幼儿配方粉与牛乳婴幼儿配方粉进行梯度配比，使牛乳婴幼儿配方粉的质量分数分别为 0%，0.5%，1%，2%，5%，10%，50%，90%，100%，做6次重复试验，结果如图4所示。采用手动积分法获取C1峰面积，6次试验均能检测到0.5%添加样品，峰面积平均值为1 106，相对标准偏差21.9%。以C1号蛋白峰峰面积为纵坐标，牛乳婴幼儿配方粉的质量分数为横坐标，绘制工作曲线，如图5所示。6次工作曲线线性相关系数0.995～0.998，说明通过测定C1号蛋白峰峰面积可以对乳粉样品中牛乳婴幼儿配方粉含量进行定性或定量检测。

图4 不同配比梯度的乳粉样品毛细管凝胶电泳图谱Fig.4 CGE maps of different proportion of cow milk powder

图5 不同配比乳粉样品C1蛋白峰峰面积6次独立试验结果Fig.5 Peak area of C1 of different proportion of cow milk powder

2.4 回收率

将牛乳婴幼儿配方粉按3%，8%和70%配比添加到羊乳婴幼儿配方乳粉中，采用毛细管凝胶电泳方法测定C1蛋白峰面积，推算牛乳婴幼儿配方粉添加量，再与配比时添加量比较，计算回收率，并做6次重复试验，回收率见图6所示。测得含牛乳婴幼儿配方粉3%的乳粉样品回收率在85.72%～119.62%之间，RSD为1.19%；含牛乳婴幼儿配方粉8%的乳粉样品回收率在91.35%～108.86%之间，RSD为0.57%；含牛乳婴幼儿配方粉70%的乳粉样品回收率在93.99%～102.38%之间，RSD为0.38%。

图6 回收率测定结果Fig.6 Measurement result of recovery rate

2.5 市售样品检测

从市场上购买4个液态羊乳产品，按照建立的方法进行毛细管电泳检测，结果如图7所示。液态羊乳1未检出C1蛋白，液态羊乳2、3、4中均出现牛乳特征蛋白峰C1，推测此3个液态乳样品中均掺有牛乳成分。

图7 市售羊乳粉样品毛细管凝胶电泳图谱Fig.7 CGE maps of commercialized goat milk powder samples

3 讨论

良好的乳源鉴别标志物应该是特异且稳定的，即在鲜乳和乳制品中呈现稳定的指标参数（迁移时间或洗脱时间或等电点）。同时选择前处理步骤少的方法，以提高检测效率，减少前处理带来的定量误差。目前在乳源鉴别方面，DNA检测技术虽然灵敏度高且稳定，但对于婴幼儿配方乳粉这种物料复杂的产品，容易因辅料的添加产生假阳性的结论。蛋白质和脂肪酸是两个最常用的检测标志物。Yurchenko等[23]报道了基于月桂酸和癸酸比例牛和羊乳HPLC-MS鉴别方法，然而需要繁琐的脂肪衍生处理步骤，不利于推广。针对蛋白质检测，目前有 HPLC-MS[24]、双向电泳[25]等方法。Chen等[24]基于β-乳球蛋白特征峰的HPLC-MS方法，针对的是新鲜的牛乳和羊乳，而乳制品，尤其是婴幼儿配方乳粉的热加工过程中美拉德反应会引起乳清蛋白峰的裂变和迁移。这个方法对婴幼儿配方乳粉的适用性还需考察。Kaminaride等[25]采用双向电泳技术，根据牛羊乳中差异蛋白组分在等电点与分子质量上的差异区分牛乳及羊乳，该方法分辨率较高，而步骤繁杂，不易重现，并很难定量。毛细管凝胶电泳操作简便、自动化程度高，容易对标识蛋白进行定性和定量检测。本研究采用毛细管凝胶电泳技术筛选到牛乳特异蛋白峰C1属于酪蛋白，含量高，确保方法稳定性和灵敏度，工作曲线线性相关系数均在0.99以上，模拟添加回收率在99.12%～105.16%之间。

通过比较C1蛋白峰和牛乳酪蛋白标准品的电泳迁移时间，初步判定C1是牛乳β-酪蛋白，而在C1的位置未观察到羊乳的蛋白峰，推断羊乳的β-酪蛋白迁移时间和牛乳不同。马露等[16]采用HPLC法发现羊乳的β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白出峰时间稍有不同，羊乳的β-酪蛋白较牛乳β-酪蛋白含量高（羊乳中20.53 g/L，牛乳中13.3 g/L）。下一步研究将验证C1蛋白身份，确证定量模型。另外，由于乳清粉是婴幼儿配方乳粉主要物料，而C1不存在于牛乳清粉中，因此需进一步研究羊乳清蛋白和牛乳清蛋白的差异。

4 结论

采用毛细管凝胶电泳技术，筛选到牛乳特征性C1蛋白峰，初步建立羊乳婴幼儿配方粉中牛乳成分的蛋白质检测方法。该方法线性关系良好，可以检测到羊乳婴幼儿配方粉中0.5%牛乳粉成分，精密度和重现性良好。