南极磷虾脂类成分的抗炎活性研究

田晓清 ，常俊男 ，2，李月月 ，2，陆亚男 ，樊成奇

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，水产品质量安全与加工实验室，上海 200090；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)

南极磷虾Euphausea superba脂类营养成分含量丰富，其脂肪酸中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)相对含量高于15%，总磷脂含量达到油脂提取物的30%以上，南极磷虾中还含有总虾青素高于3 mg·100-1·g-1[1-3]。目前，南极磷虾油(krill oil)是相关产品中营养功效和附加值都很高的产品，挪威的Aker Biomarine公司开发成功的磷虾油SKO(superbaTMkrill oil)已畅销欧美市场，商业利润极大。

南极磷虾油除了具有改善大脑健康、提高免疫、抗肿瘤等许多医疗保健功能外[4]，还具有一定抗炎功效[5]，但功效成分类型和作用靶点未见文献报道。本研究以粗磷虾油为原料，根据脂肪酸和磷脂理化性质差异，精制获得不同部位，并利用体外模型进行了抗炎活性筛选。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

不锈钢豆浆机(DJ12B-DSG1型)，广东美的精品电器制造有限公司；旋转蒸发仪(RE-3000)，上海亚荣生化仪器厂；低温冷冻离心机 (TS-211C)；高效液相色谱仪：Agilent 1260 HPLC，VWD可变波长检测器，OpenLab CDS 色谱工作站；Shimadazu，LC-20AT pump，SIL-20A auto sampler，SPD-M20A PDA；高速逆流色谱(TBE-300C)，上海同田生物技术股份有限公司。

1.1.2 实验材料

生物材料：冰冻南极磷虾(方砖：80 cm×40 cm×10 cm)来自2014年冬季南极磷虾探补渔船，-78℃冰冻保存，使用前1周转移至-18℃冷冻保存备用。

试剂：预制GF254 TLC硅胶板(青岛海洋化学公司)；液相用乙腈和甲醇(色谱级，Tedia，USA)；其余溶剂、试剂均为分析纯(上海国药集团)。

1.2 方法

1.2.1 提取

根据文献[3]报道，在室温条件下，分别取3批次冰冻磷虾，每批次1 200 g，采用固液比1:2.5、提取时间5 min、混合溶剂EA/BuOH比例为1:1的条件提取。真空浓缩干燥后，分别获得磷虾粗油48.8 g、53.2 g、49.0 g，提取率分别为4.07%、4.43%、4.08%。

1.2.2 分离和酯化

3份磷虾粗油首先分别经10倍体积(v·m-1)的无水乙醇沉淀除去固体杂质，再分别用10倍体积(v·m-1)的丙酮在4℃沉淀过夜，离心分离得到浅黄色膏状物磷虾极性脂和深红色透明磷虾油。其中，分别获得3份极性脂11.1 g、12.9 g、13.3 g，产率分别为22.8%、24.2%、27.2%；所得磷虾极性脂利用HPLC(Agilent 1260)外标法，以卵磷脂、磷脂酰乙醇胺为对照品，在206 nm测定了极性脂中磷脂总含量。获得的深红色透明磷虾油分别为38.7 g、40.3 g、35.7 g，产率分别为77.2%、75.8%、72.8%，脂肪酸成分未作分析。

称取40 g磷虾油，利用乙醇钠/乙醇回流4 h进行乙酯化，用0.5 M的稀盐酸中和，蒸出乙醇后用正己烷萃取、回收油相浓缩得粗轻油乙酯；进一步利用高速逆流色谱分离提纯，单次进样量800 mg，收集得到EPA+DHA乙酯含量较高的磷虾轻油乙酯混合物，重复多次进样，合并收集的洗脱液，真空浓缩干燥后到磷虾轻油乙酯11.3 g。并利用HPLC(Shimadazu 20AT)在215 nm归一化法分析了磷虾轻油乙酯纯化产物中EPA+DHA乙酯含量。

1.2.3 抗炎活性测试

在抑制LPS诱导的巨噬细胞NO生成实验中，通过Griess反应测定小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的NO生成。实验分为空白、对照组、LPS诱导模型组、受试化合物组(实验组)。RAW264.7细胞以5.0×105·mL-1密度接种于96孔板中，于温度37℃，5%CO2的条件下，使用DMEM培养液培养24 h。空白对照组细胞不做处理；LPS模型组细胞加入500 ng·mL-1LPS刺激24 h。各给药组分别给以受试物预孵30 min，然后加入500 ng·mL-1LPS刺激24 h。取50 μL细胞上清液，依次加入等体积Griess试剂A、Griess试剂B，轻轻振荡数次，待各孔反应液完全混匀后，于540 nm波长检测各孔OD值，根据公式计算NO抑制率。

采用ELISA方法检测磷虾极性脂、轻油、轻油乙酯对LPS诱导的巨噬细胞RAW 264.7中IL-8和IL-6细胞因子表达水平的影响。实验设置空白对照组、模型组、给药组，RAW 264.7巨噬细胞以5.0×105·mL-1密度接种于96孔板中，每孔100 μL培养基，培养24 h。空白对照组细胞不做处理，模型组加LPS 500 ng·mL-1刺激24 h，分别加入相应浓度受试物预孵30 min后，加入LPS 500 ng·mL-1刺激 24 h。IL-8，IL-6蛋白表达标准曲线按照如下步骤制作：

①加入标准品稀释液到冻干标准品IL-8或IL-6中，待彻底溶解后，静置15 min混匀(浓度为2 000 pg·mL-1)。标曲使用以下浓度：1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg·mL-1。

②除空白孔外，分别将不同浓度标准品(100 μL/孔)加入反应孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育90 min，用洗涤液洗板4次。

③每孔加入生物素化抗体工作液100 μL，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60 min，洗板4次。

④每孔加入酶结合物工作液100 μL，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30 min，洗板4次。

⑤每孔加入显色剂 100 μL·孔-1，避光反应 10～20 min。

⑥每孔加入终止液100 μL·孔-1，混匀后即刻测量450 nm处吸光度OD值。

⑦标准品的OD值减去空白孔的OD值，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，绘制标准曲线。

收集各个受试样品组的细胞培养液上清，取100 μL加入反应孔中，设2个复孔，余下步骤同上，根据标准曲线，计算每组IL-8，IL-6蛋白的表达情况。

2 结果与讨论

2.1 南极磷虾脂质不同组分的制备

根据文献分别提取3批次冰冻磷虾，获得磷虾粗油提取率达到4.07%、4.43%、4.08%，稍低于文献[3]报道，除所用南极磷虾原料不同外，提示应随着原料用量增加，适当延长剪切提取的循环时间。

利用低温沉淀法进行了磷虾粗油的分离，得到浅黄色膏状物磷虾极性脂和深红色透明磷虾轻油。其中，极性脂产率分别为22.8%、24.2%、27.2%，以磷脂为主，利用HPLC外标法测得极性脂中磷脂总含量分别为53.5%、66.0%、75.4%，平均含量65.0%（标准曲线如图1，样品图谱如图2）；磷虾轻油产率分别为77.2%、75.8%、72.8%，未能检测到卵磷脂、磷脂酰乙醇胺等磷脂成分。结果表明磷虾粗油中，脂肪酸成分存在形式以甘油酯为主，磷脂占比较小，通过溶剂低温沉淀，能较好地分离这两类成分。

磷虾轻油经乙醇钠/乙醇回流乙酯化反应，萃取得粗轻油乙酯；进一步反复利用高速逆流色谱分离提纯，得到EPA+DHA乙酯含量较高的磷虾轻油乙酯混合物，总产率28.25%。利用HPLC在215 nm归一化法分析得到纯化后磷虾轻油乙酯产物中EPA+DHA乙酯含量为61.5%，另含十六碳烯酸、油酸乙酯分别为3.7%、5.4%（HPLC图如图3）。

图1 卵磷脂标准曲线图Fig.1 Standard curve of the phosphatidylcholine

图2 南极磷虾油中测得卵磷脂样品图Fig.2 Liquid chromatogram of phosphatidylcholine in the Antarctic krill

图3 样品中EPA+DHA的HPLC图谱Fig.3 Liquid chromatogram of EPA+DHA in the Antarctic krill

2.2 南极磷虾脂质不同组分的抗炎活性

在抑制LPS诱导的巨噬细胞NO生成实验中，磷虾极性脂、轻油、轻油乙酯在NO产生抑制模型中IC50分别为146.1、129.9和52.9 μg·mL-1，且都呈剂量相关性，其中轻油乙酯活性相对较好(图1a)。

图4 磷虾极性脂、磷虾油和轻油乙酯的体外抗炎活性结果Fig.4 Anti-Inflammatory Activity of polar lipid，oil and Ethyl ester fraction of light oil from Antarctic krill

采用ELISA方法检测磷虾极性脂、轻油、轻油乙酯对LPS诱导的巨噬细胞RAW 264.7中IL-8和IL-6细胞因子表达水平的影响。结果显示：IL-8细胞因子含量测试中磷虾轻油活性优于其它2个组分 (图4b)，IL-6细胞因子含量测试中则是轻油乙酯活性最佳(图4c)，且都呈剂量相关性。

活性筛选结果表明：南极磷虾油抗炎功效的主要活性成分为多不饱和脂肪酸如EPA、DHA等，脂肪酸甘油酯混合物也显示一定的抗炎活性，而磷虾磷脂类成分活性相对较弱。

关于南极磷虾油改善心脑血管、提高免疫、抗肿瘤等的研究比较多[4]，抗炎活性的研究较少，主要都聚焦于总磷虾油的体内、体外抗炎活性[6]。本研究对磷虾油制备得到的不同类型的成分进行了活性跟踪，发现最强抗炎活性成分。活性筛选结果表明：南极磷虾油抗炎功效的主要活性成分为多不饱和脂肪酸如EPA、DHA等，脂肪酸甘油酯混合物也显示一定的抗炎活性，而磷虾磷脂类成分活性相对较弱。

3 我国南极磷虾油产品开发应用前景

南极磷虾虾油中含有丰富的EPA、DHA和磷脂、虾青素等营养物质，尤其适用于心脑血管疾病的预防和治疗，因此磷虾油产品附加值高，市场预期好。如果能进一步精制开发细分产品，有望丰富产品类型，综合提升产品附加值，适应不同的症状，满足不同的消费需求。

本研究利用磷虾油尝试制备了1种抗炎有效部位小试产品磷虾轻油乙酯，通过定量分析明确其中EPA+DHA乙酯含量，为61.5%，另含十六碳烯酸、油酸乙酯分别为3.7%、5.4%；体外抗炎活性结果显示磷虾轻油乙酯具有较强活性，且呈剂量相关，其抗炎作用主要表现为抑制炎症因子NO、IL-6。磷虾极性脂虽然磷脂平均含量达到65.0%，但抗炎活性微弱。

在开发南极磷虾虾油衍生产品过程中，已经有较多相关专利[7-9]，必须考虑各类有效成分的理化特性，尽量针对性地利用低温、真空等加工过程，在产品形式、制备工艺、制剂上大胆创新，才能最终开发出拥有自主知识产权、品质优良的磷虾油终端产品。本研究首次尝试在南极磷虾油精制过程中使用了高速逆流色谱技术[10-11]分离超低极性的油脂类化合物，较之于反相HPLC等固相色谱技术，载样量提升较大，样品回收率高，分离效果也达到了预期目的。

致谢：感谢中山大学药学院尹胜教授团队进行磷虾极性脂、磷虾油和轻油乙酯抗炎活性评价，感谢上海同田生物技术股份有限公司指导EPA+DHA乙酯的纯化试验。