SAT在活动性肺结核疑似患者中的应用研究

刘亚芹，杨振斌

（聊城市传染病医院检验科，山东 聊城252000）

结核病是当今全球范围对人类最具威胁的感染性疾病之一，我国是全世界结核病负担最高的国家之一，发病率全球第三［1］。其中肺结核占结核病的比重最大，而控制肺结核病的有效手段就是实验室检查确诊病原，当前基层结核病实验室所采用的痰涂片敏感性低，痰培养周期长，4～8周，患者往往因待诊时间长而贻误病情，因此探索一种结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）高效的检测方法，快速准确诊断肺结核对控制结核病疫情具有重要意义。核酸恒温扩增检测（simultaneous amplification and testing，SAT）技术，能特异性的检测MTB的核糖体16SrRNA，通过莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV-RT）、T7 RNA多聚酶和优化探针技术共同来实现高效检测。本文通过对活动性肺结核疑似患者的SAT结果分析，来评价SAT检测在活动性肺结核患者中的应用价值。

材料和方法

1 材料

1.1 病例 对2015年7月1日至2017年6月30日来我院就诊的仅胸部X线检查显示与活动性肺结核相符的病变患者（活动性肺结核疑似患者）281例纳入分析。

1.2 检测项目 嘱患者留取5mL以上痰标本送检，标本被平分成3份同时进行中和离心法的MTB的培养、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测、SAT检测。AT法的

2 仪器与试剂

2.1 仪器 ①SAT：美国ABI7500实时荧光定量PCR仪，超声波处理器，高速离心机、混匀仪。②PCR：厦门安普利Genelight2400荧光PCR仪。③中和离心法培养：上海精宏GNP-9270恒温箱，上海舜宇FA1604型电子天平。

2.2 试剂 ①SAT：上海仁度公司试剂盒，含稀释液、检测液、酶（M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶）反应液等。②荧光PCR：厦门安普利MTB-DNA荧光定性试剂盒。③中和离心法培养：中性罗氏（L-J）培养基，鉴定用对硝基苯甲酸（PNB）培养基、噻吩-2-羧酸（TCH）培养基。

3 方法

3.1 培养和鉴定 ①中和离心法培养：取2mL痰入离心管，加1～2倍体积的N-乙酰-L半胱胺酸（N-acetyl L-cysteine，NALC）震荡10s，静置15min，加磷酸盐缓冲液40mL，3 000g离心20 min，沉渣两滴接种中性L-J。②鉴定：将培养物制成10-3mg／mL菌液，分别接种于L-J、PNB、TCH，并设标准菌株参比，37℃培养4周观察结果。

3.2 SAT检测 1mL痰加等量4%氢氧化钠（NaOH）震荡1min，静置15min，取1mL，13 000r／min离心5min，沉渣加50μL稀释液，超声功率300W 15min后，取2μL加30μL扩增检测液放恒温仪60℃10min，42℃5min，再加10μL SAT酶液，置ABI7500荧光PCR仪中反应。程序：荧光标记选择羟基荧光素，42℃l min，40个循环。

3.3 荧光PCR检测 1mL痰加等量4% NaOH处理20 min，12 000g离心5min，去上清加50μL处理液，96℃10min，12 000g离心5min，10μL入10×PCR扩增系统管，加20μL稀释液在Genelight 24000荧光PCR仪中扩增，程序：95℃，2min；75℃，15s；52℃，40s，40个循环。

4 结果判读说明

SAT：阳性（0＜dt＜35），阴性（dt＝0或40）。dt为样本曲线与阈值交点的横坐标。阈值：阈值线为刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

PCR：阳性（0＜ct＜35），阴性（ct＝0或40）。ct为样本曲线与阈值交点的横坐标。临界阳性ct大于强阳性对照的ct值，并小于38。

5 统计学处理

应用SPSS17.0软件进行数据处理，对两种方法在结核分枝杆菌检测中的比较采用配对四格表资料的χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

在281例经X射线检查显示与活动性肺结核疑似的患者中通过PNB、TCH鉴定出12例非结核分枝杆菌（non-tuberculousmycobacteria，NTM）。对这12例非结核分枝杆菌，中和离心法培养、SAT均检测为阴性，只有PCR检测为1例MTB阳性，后经基因测序鉴定为堪萨斯分枝杆菌（重做了PCR结果为阴性，考虑PCR的污染导致）。除去这12例NTM，其他269例患者，中和离心法培养、PCR、SAT的检测MTB阳性的例数分别为179、190、189，这三种检测方法阳性率最高的为PCR 70.6%，SAT为70.3%，与PCR非常接近，培养法的阳性率最低为66.5%。

以中和离心法培养为金标准，PCR与中和离心法培养的结果比较如下表1所示。

表1 PCR与中和离心法培养检测MTB结果的比较

根据表1的结果，经卡方分析，χ2＝4.8，P＝0.029，说明PCR与中和离心法培养两种方法在MTB检测中差异有统计学意义，PCR检测MTB的灵敏度为97.2%，特异性为82.2%。SAT检测与PCR检测MTB的结果比较如表2所示：

表2 SAT与PCR-DNA检测MTB的结果比较

以中和离心法培养为金标准，SAT检测与中和离心法培养检测MTB结果显示SAT检测MTB的灵敏度为98.3%，特异性为85.6%，经卡方分析，χ2＝5.1，P＝0.024，说明SAT与中和离心法培养在MTB检测中差异有统计学意义。

讨 论

结核病的诊断方法目前主要包括痰涂片镜检、培养法、免疫学、分子诊断技术等［2-3］。培养虽是检测MTB的金标准，但耗时长，中和离心法的培养需时3～8周，当前PCR在MTB的检测中应用较多，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，从而更容易准确诊断肺结核［4］。已有研究报道，PCR检验在肺结核早期诊断中的应用价值较高且准确率较高［5-6］。PCR操作中仍需特别注意实验器材的污染问题，以免出现结果假阳性，本研究中PCR在检测12例NTM时也出现了这个情况。又因细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释放出DNA，以致造成PCR检测的假阴性。本研究中，在269例活动性肺结核疑似患者中，SAT检测MTB的灵敏度（98.3%）和特异性（85.6%）均高于PCR的特异性（97.2%）和灵敏度（82.2%）。SAT技术是第二代核酸检测技术，靶标RNA在RT酶作用下经过反转录合成一条带T7启动子的双链DNA，T7 RNA聚合酶以这条双链DNA为模板不断地合成RNA，新合成的RNA经过反转录过程又可以合成双链DNA，如此往复，以此达到扩增的目的。SAT检测结核菌核糖体RNA，核糖体RNA的含量在每个结核菌里面达到了2 000个拷贝，所以MTB-SAT检测的灵敏度非常高，SAT还利于疗效评估，患者在用药后，病原体死亡，RNA随之降解，所以RNA检测是活菌检测，检测结果直观反映结核菌在体内的存活状态，利于临床用药治疗效果的评估。RNA容易降解，也不易造成实验室的后续污染。综合来看，以16s RNA为靶标的SAT技术在不同程度上提高了检测结果的灵敏度和精确度，2～3 h即可获得检测报告［7-8］。而且SAT检测试验要求较荧光PCR扩增法低，恒温反应，耗时短，成本低，值得在MTB检测中推广应用。