MTHFR基因多态性检测试剂盒的性能验证

刘玉兰，吴允凤，高川川，孙艳艳

（首都医科大学石景山教学医院，北京市石景山医院，北京100043）

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢的关键酶，叶酸代谢相关基因多态性可以导致叶酸血药浓度水平差异较大，通过检测患者叶酸代谢相关基因多态性以及叶酸和同型半胱氨酸（Hcy）的水平，评估叶酸代谢能力，可以为患者制订个体化的叶酸补充方案。根据国家卫生计生委2015年颁布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》（简称指南）要求，无论是使用经国家药品食品监督管理总局（CFDA）批准的试剂盒还是通过国家卫生计生委个体化医学检测试点单位性能评定、具有严格标准操作规程（SOP）的自制试剂（laboratory developed test，LDT）进行的检测项目，医学实验室在开展临床检测前都需要对其进行性能验证，并建立相应的性能规范，并根据性能规范确定系统的校准和质控程序，保持性能特征建立、校准和质控程序相关活动的记录，以保证检测结果的准确、可靠［1］。同时，对选用试剂进行性能验证也是北京市临床基因扩增实验室技术评审的考核条件之一。本文旨在对该实验室选用的人MTHFR基因多态性检测试剂盒的性能进行验证，以确保其性能满足医学实验室的要求。

资料与方法

1 一般资料

选取2017年10月来北京市石景山医院心脏内科门诊就诊的高血压患者20例，采集患者EDTA-K2抗凝静脉血2mL。

2 仪器与试剂

TL-988型荧光定量PCR仪（西安天隆科技有限公司），3730XL型测序仪（美国应用生物系统公司），人MTHFR基因多态性检测试剂盒（荧光PCR法）（苏州旷远生物分子技术有限公司，国械注准20173403239）及配套的核酸提取纯化试剂盒。

3 方法

3.1 准确性 对20例标本的MTHFR基因多态性进行检测，将结果与测序（金标准）结果进行比较，以验证试剂盒的准确性。

3.2 精密度 采用实时荧光PCR对杂合型标本重复扩增10次，以验证试剂盒的精密度。

3.3 最低检测限 将厂家提供的杂合型DNA标本（已知浓度为19.8ng/μL）用蒸馏水进行倍比稀释至检测限（10ng/μL）下的浓度9.9 ng/μL，重复检测3次，以验证试剂盒的最低检测限。

结 果

1 准确性

20例标本的MTHFR基因多态性检测结果见图1～图3，包括野生型（CC）5例，杂合突变型（CT）8例和纯合突变型（TT）7例，实时荧光PCR的检测结果与测序结果完全符合，符合率为100%（20/20）。

图1 野生型CC实时荧光PCR与Sanger测序法结果比较

图2 杂合突变型CT实时荧光PCR与Sanger测序法结果比较

图3 纯合突变型TT实时荧光PCR与Sanger测序法结果比较

2 精密度

批内重复10次的分型检测结果与实际基因型完全相符，且所有通道的CT值变异系数CV≤5%，见表1。

表1 实时荧光PCR Ct值的批内CV（%）

3 最低检测限

稀释到检测限下的三次重复实验均能准确进行分型。

讨 论

研究表明，高同型半胱氨酸血症是冠心病的独立危险因素［2］，其高水平可能与高血压病的发病相关。血浆中同型半胱氨酸水平是由营养状况和遗传因素共同决定的。而基因方面最主要的决定因素是MTHFR基因C677T基因多态性。1988年，KANG S S等［3］的研究就认为MTHFR基因第677位碱基对上的丙氨酸替代缬氨酸的突变是一种常见突变，且该突变会影响血浆Hcy的代谢，导致高同型半胱氨酸血症和低叶酸水平。

研究指出，叶酸缺乏和高Hcy与习惯性流产和一些不良妊娠事件（如妊娠诱发的高血压、先兆子痫和胎盘早剥等）有关［4］。叶酸缺乏可导致胚胎NTD（神经管畸形）和先天性心脏畸形［5］。ZINTZARASE等的研究肯定了MTHFR C677T基因多态性与唐氏综合征的相关性［6］。

此外，文献报道MTHFR基因677 C-T突变还是2型糖尿病、糖尿病肾病及糖尿病视网膜病、白血病、结肠癌、深静脉血栓和精神焦虑、抑郁等疾病的风险因子［7］。

MTHFR基因C677T基因多态性会导致机体对叶酸的吸收代谢能力存在个体差异，使用相同剂量治疗易导致预期疗效降低或无效，因此，检测基因多态性，估算叶酸代谢能力，并据此调整叶酸补充剂量的个体化用药很有必要。

MTHFR基因多态性检测属于定性检测项目，参考美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的EP12-A2文件，定性检测方法的性能验证指标主要包括重复性/精密度、准确性（突变型的检测能力）和检测限3个方面［8］。

依据以上要求，本文对该试剂盒进行了准确性、精密度和检测限的验证。根据指南中的要求，准确性的评价有两种方法：一种是直接检测已知标准的标准物质，将检测结果与已知标准值进行比较；另一种是同时采用待评估项目与标准方法（或参考方法）对同一批次样品进行分析，比较二者的检测结果［1］，本文采用后者，将20例标本的MTHFR基因多态性检测结果，与金标准-测序结果进行比较，结果完全符合；定性项目的精密度是指一份阳性或阴性样本在多次检测中，是否能得到可重复的阳性或阴性结果，本文中，重复扩增10次的分型检测结果与实际基因型完全相符，且所有通道的CT值变异系数CV≤5%，表明检测体系的重复性高；检测限是指可被检测体系检出的最低检测浓度，又称最小检测浓度或检测底限，本文中，稀释到检测限（10ng/μL）下的浓度9.9 ng/μL的三次重复实验均能准确进行分型，表明试剂盒具有足够的检测能力。

通过验证，确认试剂盒的性能已经达到了生产商说明书上声称的检测要求，可以应用于医学实验室，为临床提供准确、可靠的结果。