转甲状腺素蛋白在结直肠肿瘤患者血清中的差异表达

胡慧慧，张 曼

（首都医科大学附属北京世纪坛医院 北京大学第九临床医学院 尿液细胞分子诊断北京市重点实验室，北京100038）

转甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）又名前白蛋白，分子量55kDa，以同源四聚物的形式存在，四聚物分子量14kDa。TTR在人类肝脏、脉络丛与小肠合成，首先在人类脑脊液与血清中被发现，在人体内转运甲状腺素，同时与视黄醇结合蛋白（retind protein，RBP）结合转运视黄醇与维生素A［1］。所有物种在生长发育的整个阶段肝内一直合成TTR，同时伴随血清中蛋白水平的升高。对于肝内甲状腺素合成保持的原因有两种解释，解释一是关于肝脏TTR基因合成的保持与体质量比率中脂质池的增加相一致，另一种解释是成年体内肝脏TTR的合成与体温恒定相关联。以上说明，TTR对维持人体正常生理功能发挥重要作用。目前，关于TTR与结直肠癌的报道已成为一个热点。结直肠癌患者的血清与正常人、结直肠息肉患者血清相比，TTR的表达是下调的。而正常人与结直肠息肉之间的TTR的表达却没有差异。因此，TTR可以在结直肠癌中发挥肿瘤标志物的作用［2］。并且在结直肠癌发生淋巴结转移与未发生淋巴结转移的患者血清中，TTR存在差异表达。在发生淋巴结转移的结直肠癌患者血清中，TTR的表达是下调的［3］。我们曾报道，发生远处转移的结直肠癌患者血清，与未发生远处转移的患者血清相比，TTR的表达同样是下调的。可以得出结论，TTR与人类结直肠癌的恶性度存在相关性。而TTR与结直肠肿瘤患者不同分期之间的相关性没有相关报道。本实验收集12例正常人，12例结直肠息肉与47例结直肠恶性肿瘤患者血清，利用Westernblot的方法检测TTR是否存在差异表达。

材料和方法

1 研究对象

收集12例正常对照，12例结直肠息肉，47例结直肠恶性肿瘤患者的血清。所有受试者信息均按年龄、性别、分期，详细信息见表1。研究对象均排除其他恶性肿瘤、血液系统、甲状腺疾病、急慢性感染等其他疾病。本研究的开展经医院伦理委员会批准。

表1 入组患者信息表

2 方法

Western blot：血清样本总蛋白浓度经定量后，2×Loading buffer（鼎国昌盛，中国）与含60μg总蛋白体积的血清1∶1混匀，进行SDS-PAGE，其中电泳浓缩胶电压60V，分离胶120V。半干电转仪转膜25V，90min，封闭液封闭90min（封闭液PBST+5%脱脂奶粉）。杂交一抗，其中TTR（Abcam，USA）比例1∶1000，β-actin（Santa Cruz）1∶400，稀释剂为封闭液，4℃过夜。PBST（PBS+0.05% Tween）洗膜三次，每次20min。杂交二抗（Dingguo，China），室温摇床孵育90 min，PBST洗膜三次，每次15min，DAB显色液对膜进行显色5min。Image J分析软件对条带光密度进行鉴定。

3 统计学处理

使用SPSS22.0进行统计学分析。实验数据用均数±标准差表示，组间比较使用方差分析法。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

1 TTR在正常人、结直肠息肉及结直肠癌患者血清中的表达

在血清中，TTR在结直肠恶性肿瘤中的表达下调。TTR在正常组、息肉组与癌症组的灰度比值分别为15.81±4.38、15.37±3.04、7.61±3.44。在正常人与结直肠恶性肿瘤，结直肠息肉与结直肠恶性肿瘤患者中，TTR的表达差异具有统计学意义（P＜0.001，P＜0.001）。

图1 TTR在12例正常人（C1-C12）血清中的表达

图2 TTR在12例结直肠息肉患者（P1-P12）血清中的表达

图3 TTR在12例结直肠肿瘤患者（T1-T12）血清中的表达

图4 TTR在正常人、息肉及结直肠癌患者表达统计分析

2 TTR在不同分期结直肠癌患者血清样本中的表达

TTR与患者的年龄、性别没有相关性（P＞0.05）。TTR在pT1、pT2、pT3及pT4组的灰度比值分别为8.61±2.95、7.17±1.15、6.39±1.89、4.78±0.95。TTR在pT1（I期）与pT4（IV期）样本中的表达具有差异（P＝0.004），在pT4期中，TTR呈低表达状态。其他组别之间的差异没有统计学意义（P＞0.05），见图5。

图5 TTR在不同分期肿瘤患者表达的统计分析

讨 论

TTR结合的配体十分多样化，这就决定了TTR在人体发挥的功能具有多样性。这些配体分为两类：“天然配体”与“合成配体”。“天然配体”包括 甲状腺素（T3与T4）与视黄醇，“合成配体”包括非类固醇抗炎药物，多氯双酚化合物与阻燃物［1］。CHANG等［4］报道TTR的N末端与配体的结合紧密性相关。短而多的亲水性N末端与T4更加紧密的结合。因为TTR的C末端与TTR结合中心“通道”，所以C末端的片段可能影响TTR与THs结合的亲和力［5］。TTR结合配体的多样化决定了其在体内发挥功能的多样化，尤其与人类肿瘤的发生发展存在密切的联系。

目前关于TTR与消化道肿瘤的报道。TTR在消化道肿瘤组织中大部分成低表达状态。LIU等［6］研究在胆管上皮细胞癌患者血清中，TTR的表达水平显著下调。在临床胆管上皮细胞癌的诊断中TTR可以作为CA19-9的辅助标志物作用。在胰腺癌相关性的研究中，TTR在胰腺癌患者血清中表达上调，与慢性胰腺炎与胆总管结石患者相比，上调幅度可以达到2倍。TTR在胃癌相关性研究中，通常被作为评价营养状态的一个指标［7］。LIU等［8］报道在胃癌术后营养支持的患者中，根据营养状态的不同分为三大组，肠内营养、肠外营养及混合营养，研究结果表明TTR在混合营养中的水平远远高于肠内营养及肠外营养组，而肠内外混合营养胃癌患者的术后最好。同样在食管癌合并糖尿病的患者群体中，TTR同样可以发挥营养状态指标的作用。

MOORE等［9］报道，在卵巢癌高发人群中，在CA125＞35U/mL时，TTR联合APOA1检测可以提高卵巢癌的诊断的特异性及灵敏度。BEATE等［10］报道TTR由卵巢癌组织修饰后分泌，血清与腹水中TTR的表达存在差异，腹水TTR的表达可以反映血管对TTR的过滤情况。在宫颈癌与TTR相关性研究中，TTR在癌症中同样表达下调，在与CA125相比，TTR在pT2与pT3分期肿瘤中的灵敏度与特异性十分低。LIU等［8］研究在胆管上皮细胞癌患者血清中，TTR的表达水平显著下调。在临床胆管上皮细胞癌的诊断中TTR可以作为CA19-9的辅助标志物作用。

本研究发现，在血清中，TTR在与结直肠肿瘤的分期具有相关性，我们之前的研究曾证实，TTR与结直肠恶性肿瘤是否转移存在相关性，在发生远处转移患者的血清里，TTR的表达要低于未发生远处转移患者组［11］。在血清中，与正常人与结直肠息肉患者相比，TTR在结直肠恶性肿瘤中的表达下调。TTR在pT1（I期）与pT4（IV期）样本中的表达具有差异，在pT4期中，TTR呈低表达状态。以上结果说明，TTR的表达与结直肠肿瘤的恶性度存在相关性，TTR在结直肠肿瘤的发生发展中发挥重要作用。TTR可以为结直肠肿瘤的诊断及诊疗发挥肿瘤标志物的作用。

综上研究，TTR与肿瘤的发生发展、浸润、远处转移均有不同程度相关，这可为临床上肿瘤的早期发现和治疗提供新靶向。但许多作用机制尚不明了，如为何TTR在不同肿瘤组织中表达差异；TTR与致癌基因、抑癌基因、信号传导、细胞增殖和凋亡的关系。这些问题都有待进一步研究，以充分阐明其作用机制，判断TTR在肿瘤诊断与治疗方面的价值。