基于分子模拟的壳寡糖-金属配合物的结合模式分析

吕丹丹 张 宾 房传栋 谢枫才 邓尚贵

（浙江海洋大学 浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室 浙江舟山316022）

壳寡糖又称为低聚寡糖、壳聚寡糖或几丁寡糖，是经壳聚糖降解得到的一种低聚合度的碱性氨基寡糖，其具有诸多生物活性，如提高免疫力，抑制癌肿细胞，降血脂、血压，消除氧负离子自由基等，目前已广泛应用于农业、医学、食品及药品等多个领域[1-2]。壳寡糖分子中含有大量-NH2和-OH，可与多种金属离子发生配合反应，形成壳寡糖-金属配合物，从而增强壳寡糖原有特性或形成新的生物功能，如制备的壳寡糖-锌配合物具有促进动物大脑发育功能[3]，壳寡糖-稀土元素配合物可有效脱除贝类体内重金属元素[4]，壳寡糖-镧配合物的抑菌活性显著增强[5]等。

近年来，关于壳寡糖-金属配合物的结构特征研究报道较多。王金明等[6]通过元素分析发现，壳寡糖对锌离子饱和吸附量为625 mg/g，推测壳寡糖和锌离子配位比为3∶1（即壳寡糖配位数为3）。郭振楚等[7]对壳寡糖-镧和壳寡糖-铈配合物进行研究，指出壳寡糖分子中4 个氨基葡萄糖残基与1 个镧离子进行配位，该配合物中C∶H∶N ∶Ce 原子个数比为24.61∶44.53∶4.10∶1.00，壳寡糖单元残基配位数为4。任群翔等[8]对壳寡糖-铕、壳寡糖-铽两种配合物采用红外光谱、紫外光谱、荧光和X 射线光电子能谱等分析手段进行表征，发现壳寡糖氨基上N 原子和仲羟基O 原子参与金属配位。目前，关于壳寡糖与金属离子的配位比例，结合位点及配合物稳定性等方面，尚无法达成共识，且仅依靠现有检测技术，如核磁共振、元素分析、光谱及色谱分析等，均无法准确获知其具体结构信息[9-10]。本研究以壳寡糖-Fe2+/Zn2+/Mg2+为对象，采用分子动力学模拟技术，研究壳寡糖分子与金属离子间的结合模式，旨在从分子结合理论角度探寻壳寡糖-金属配合物的结构信息，为现代仪器分析提供重要辅证和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用壳寡糖（壳三糖，C18H35N3O13，上海甄准生物科技有限公司）为目标对象，金属离子以Fe2+，Zn2+和Mg2+为配位配体，分析壳寡糖与金属离子间的结合方式及配位关系。前期研究发现，壳三糖与金属配位结合后，其生物活性如对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制活性较好，且其体内外抗氧化作用也显著优于其它聚合度的壳寡糖，因此本研究选择三糖开展结合方式分析（结果将另文报道）。

1.2 分子动力学模拟

分子模拟软件：Amber12 分子模拟软件，由加利福尼亚大学（旧金山，美国）开发[13]。

模拟体系建立：动力学模拟体系中，壳寡糖与Fe2+/Zn2+/Mg2+离子数目配比为1∶1，体系中壳寡糖、金属离子数均为141 个，分别进行3 组各100 ns的分子动力学模拟研究。

模拟参数限定：Fe2+、Zn2+和Mg2+采用Amber ff14SB 力 场[11]，糖 类 分 子 采 用AMBER GAFF 力场[12]，应用Ambertools 对模拟体系进行处理，获得动力学模拟所需的力场文件和坐标文件。为保持模拟体系的电中性，加入适量Cl-以平衡电荷；随后对体系进行能量优化，使得体系适合动力学模拟与分析。

模拟过程及操作：采用Amber12 中Sander 模块[13]，在模拟过程中约束溶质，限定约束力常数为10 kcal/mol/Å2，然后对体系进行5 000 步最陡下降法和5 000 步共轭梯度法优化，之后在1 ns 模拟时间内将系统从0 K 加热到300 K；随后进行1 ns 常温300 K、常压1.01×105Pa 动力学平衡，最后进行100 ns 常规动力学模拟。模拟中采用SHAKE方法[14]，限制所有含氢原子键的伸缩，模拟步长2 fs；静电作用使用PME 方法[15]，且使用周期性边界条件，非键相互作用截距为1.2 nm；模拟体系坐标，每隔1 ps 保存1 帧，每个体系各模拟100 ns时间。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖分子结构及模拟体系的建立

依据壳寡糖分子式及基本结构信息，利用Amber12 软件构建并优化壳寡糖（三糖）结构，模型示意图如图1a 所示。在水溶液体系中，将壳寡糖分子与各金属离子（Fe2+/Zn2+/Mg2+） 进行1∶1 混合，形成分子动力学模拟初始体系（图1b）。分别以壳寡糖-Mg2+、壳寡糖-Fe2+和壳寡糖-Zn2+体系为基础，通过动力学模拟，分析壳寡糖与金属离子间的结合方式、位点及空间结构信息等。

图1 壳寡糖与金属离子体系的构建示意图Fig.1 The schematic diagram of chitooligosaccharides and simulation system

2.2 壳寡糖-金属配合物体系的动能、势能和总能量变化

为评估各模拟体系的平衡状态，对模拟体系中动能、势能和总能量随模拟时间的变化情况进行分析，结果如图2所示。各体系在50 ns 后，动能、势能和总能量波动均相对较小，基本处于平衡状态。因此，为获得较准确的相互作用能及动力学模拟信息，研究分析均采取平衡后的轨迹信息（50～100 ns）。由结果可知，各模拟体系总能量变化不大，经短期模拟后即达到稳定状态，其原因可能由于采用的初始结构已经进行了能量优化的原因。该结果也说明，试验构建的壳寡糖分子结构及限定的分子动力学模拟参数，具有较高可行性与合理性，可保证后期结果分析的有效性。

图2 各模拟体系能量（动能、势能和总能量）随时间变化情况Fig.2 The curves of kinetic energies，potential energies and total energies for the different simulations

2.3 壳寡糖与金属离子结合数量分析

通过对各模拟体系平衡轨迹分析，获得各金属离子与壳寡糖的结合数量情况，如表1所示。由结果可知，虽各模拟体系中壳寡糖、金属离子总数保持一致（均为141 个），但金属离子可与壳寡糖结合的总数目略有不同。Mg2+、Fe2+和Zn2+与壳寡糖发生了结合反应的总数目分别为107.96，113.85和115.17，即Mg2+被壳寡糖结合的总数目最少，而Zn2+被结合总数目最多。更进一步，通过单个金属离子所能结合的壳寡糖数目分析发现，Mg2+、Fe2+和Zn2+分别可与1.35、1.32 和1.37 个壳寡糖分子相结合。由此可见，每个金属离子基本与1～2 个壳寡糖分子结合，而每个壳寡糖分子结合金属离子（Mg2、Fe2+和Zn2+） 数目分别为2.37，2.22 和2.21。研究表明，在相同条件下，壳寡（聚）糖分子与金属盐离子相互作用后，形成金属配合物的配位数（结合数量）有所不同，表明不同金属离子与壳聚糖的结合能力存在一定差异。有文献报道指出，壳寡糖与金属离子间的配位能力依次为Cu2+＞Co2+＞Ni2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+[16]，该结果与本试验获得部分内容相符。

表1 壳寡糖与各金属（Mg2+、Fe2+和Zn2+）离子的结合信息Table 1 The combination of chitooligosaccharides and metal ions （Mg2+，Fe2+ and Zn2+）

2.4 壳寡糖与金属离子间的结合位点分析

为进一步衡量壳寡糖中各原子与金属离子间结合能力的强弱，对壳寡糖中各原子所结合的金属离子数目进行统计，结果如图3所示。可见，壳寡糖中能与金属离子结合的原子，主要集中在氨基氮原子 （N、N1 和N2） 和羟基氧原子（O1、O2、O3、O6、O7、O10、O11 和O12）；而 醚 氧 原 子（O、O4、O5、O8 和O9）中，除醚氧原子O9 外，其余氧原子未与金属离子产生结合作用。此结果显示，能与金属例子发生配位结合的壳寡糖位点，主要为氨基氮原子和羟基氧原子。

在pH 值接近中性的溶液体系中，壳寡糖中活性基团可结合金属离子，其反应机制主要为配位作用[17]。部分研究通过X 衍射、红外、紫外及荧光光谱分析发现，壳聚（寡）糖与Cu2+/Zn2+之间形成配合物的结合位点，主要为氨基和羟基[18]。壳寡糖中氮原子外层5 个电子，其中3 个已配对成键，而剩下1 对孤对电子，失去电子可能性较小，很容易提供孤对电子而与金属离子结合形成配合物，即氮原子为金属离子结合的重要位点。相比较而言，羟基中氧原子外层有6 个电子，电负性较氮原子更强，因此不易给出孤对电子，对金属离子电子层构型影响也较小，因而其配位能力也相对较弱。

为获得壳寡糖分子与金属离子可能的结合配比关系，统计分析平衡轨迹中各寡糖分子所能结合的相同金属离子数目，如图4所示。模拟结果显示，最多可有3 个壳寡糖分子与同1 个金属离子发生配位结合，而该种模式在壳寡糖-金属配合物中占比较少。而1 个壳寡糖分子与1 个金属离子相结合的配位模式最为普遍，但也存在大量的2个壳寡糖与同1 个金属离子相结合的模式存在。文献报道表明，壳寡（聚）糖与金属离子Cu2+相互作用，可能主要有两种模式：Cu2+以“桥”的形式，连接同一或不同糖分子链上的两个或多个基团，从而形成分子内或分子间络合物；或者，Cu2+以“悬挂”的方式，与壳寡（聚）糖中自由氨基结合而形成配合物[9，19]。本研究结果显示，在壳寡糖与金属离子混合体系中，主要存在着壳寡糖分子与金属离子个数以1∶1 和2∶1 两种配位模式，符合“桥式”和“悬挂”结合模式理论。同时，此部分研究结果，也与表1结合数量分析结果相一致。

图3 壳寡糖与金属离子间的结合位点分析Fig.3 The binding sites of the metal ions located on the chitooligosaccharides chain

2.5 壳寡糖与金属离子结合构象分析

图4 壳寡糖与金属离子间的相互结合数量分析Fig.4 The ratio of chitooligosaccharides to metal ions during the chelation

在模拟体系中，壳寡糖与金属离子以1∶1 的比例，形成配位物结构较为简单（结合模式图略）。进一步分析发现，2 个壳寡糖分子与同1 个金属离子相结合的模式，在各个金属离子及多种糖类配合物中也均普遍出现，且该模式也符合金属离子的配位规律。因此，进一步通过聚类分析，在该配比关系下，获得壳寡糖分子与金属离子（Mg2+、Fe2+和Zn2+）结合的典型配位结构，如图5所示。结果发现，金属离子主要与壳寡糖分子中的N 原子和O 原子形成4 配位的结合模式。也有研究通过试验证实，壳寡（聚）糖可与金属离子形成4 配位体模式[20]，其推测结果与本研究相一致。本试验中，壳寡糖中的-NH2、-OH 与金属离子发生配位，形成金属离子-N、金属离子-O 两种配位键。依据配位理论，原子电负性越小，其吸引电子能力越小，因此N 原子更易于将其孤对电子与金属离子共享，所以壳寡糖中N 原子与金属离子的配位能力较O 原子更强。在配合物结构中，直接表现为金属离子-O 原子键较金属离子-N 原子键更长 （图5），该结果与本模拟分析获得结果相一致。

研究表明，壳寡（聚）糖与金属离子的结合反应为放热反应，反应形成配合物的稳定性与金属离子类型，形成配合物内部氢键，原子空间分布等因素密切相关[17]。为验证以上典型结合模式的稳定性，采用半经验量化法对获得结合模式进行优化，然后进行相互作用能分析，结果如表2所示。在模拟体系中，Mg2+、Fe2+和Zn2+与壳寡糖分子间的相互作用能力依次增强，这与表1中所发现的体系中结合总离子数目结果相一致，即Zn2+最容易与壳寡糖发生配位且结合能力最强（-161.07 kcal/mol），而Mg2+相对而言与壳寡糖分子间相互作用能较弱（-103.51 kcal/mol），Fe2+与壳寡糖的结合能力（-149.98 kcal/mol）居中，即壳寡糖与3 种金属离子反应产物稳定性强弱表现为Zn2+>Fe2+>Mg2+。

图5 壳寡糖与金属离子（绿色球）间的典型结合模式图Fig.5 The schematic diagram of chitooligosaccharides chelated metal ions （green ball）

表2 壳寡糖与各金属离子间的相互作用能分析Table 2 Interaction energies between chitooligosaccharides and metal ions after the simulations

3 结论

采用分子动力学模拟方法，以壳寡糖-金属配合物为对象，研究配位结合过程中，壳寡糖分子与金属离子间的结合关系。结果发现，壳寡糖分子主要以1∶1 和2∶1 两种配比与金属离子相结合，形成“悬挂”和“桥式”两种配位模式，其结合位点主要为氨基氮原子和羟基氧原子。本研究探索了分子模拟技术在糖类结构研究中应用的可行性，也为糖类分子与金属离子间的相互作用机理的解析提供一定参考。