红松松仁提取物对糖尿病小鼠的降血糖活性

刘迪迪 邱军强 张 华 魏增衍 王振宇*

（1 哈尔滨工业大学化工与化学学院 食品科学与工程系 哈尔滨150090 2 黑龙江省农业科学院 食品加工研究所 哈尔滨150086 3 海南医学院 药学院 无机化学与分析化学教研室 海口570100）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种由遗传因素、自由基、免疫功能紊乱、微生物感染及毒素、精神因素等多种致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退，胰岛素抵抗，而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱的综合症，是一种以高血糖为特征的代谢性疾病[1-3]。糖尿病大致可分为两种：胰岛素依赖型（I 型）、非胰岛素依赖型（II 型），后者是最常见的糖尿病类型，占所有糖尿病疾病的90%～95%，会导致严重的健康及经济问题[4]。

世界成人糖尿病人数为3.47 亿，而至2030年这个数字可能会翻一番还多。2012年，糖尿病是造成150 万人死亡的直接原因[5-6]。迄今为止，都未能找到根治糖尿病的方法，然而可以通过控制饮食，辅以运动或药物等控制血糖升高，防治并发症。目前，临床治疗糖尿病常用合成口服降糖药物，长期服用均有一定的不良反应及毒副作用[7-8]，如低血糖，脏器损伤。近年来很多研究学者致力于从植物资源中寻求治疗糖尿病的药物[9]。

红松（Pinus koraiensis Sieb.Et Zucc）主产于我国黑龙江省东北部长白山、小兴安岭等山林地区，红松松仁营养丰富，食疗价值较高，《本草纲目》记载：“松仁性温、味甘、无毒、主治关节风湿、头眩、润五脏、逐风痹寒气、补体虚、滋润皮肤、久服轻身不老”。有研究表明松仁具有多种免疫药理活性，对造血系统有明显作用，对抗肿瘤，抗辐射损伤也显示较好的效果，且具有软化血管，降低血脂、胆固醇、甘油三酯，增强耐力，抗疲劳的疗效，还具有抗氧化，延缓衰老等功能[10-14]，具有广阔的应用开发潜力，然而，对于降血糖功能还未有报道。本研究选取松仁脱脂粉为研究对象，以其稀碱提取物灌胃高糖高脂饮食，结合链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠，考察其降血糖功能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红松松仁，伊春红松树林成熟球果。

链脲佐菌素（STZ），中国Biosharp 公司；血清胰岛素，北京索莱宝科技有限公司；盐酸二甲双胍片，上海北杰集团关东药业有限公司；生理盐水，哈尔滨三联药业股份有限公司；石油醚，天津市东丽区天大化学试剂厂；柠檬酸钠、柠檬酸、氢氧化钠均为国产分析纯级，天津光复化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；匀浆机（FA-25 型），上海弗鲁克流体机械制造有限公司；数控超声波仪（KQ-500DE 型），昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪（R-1005 型），郑州长城科工贸有限公司；离心机（H2050R 型），长沙湘仪离心机仪器有限公司；全波长酶标仪，美国Thermo Electron 公司；血糖仪（GA-3 型），三诺生物传感股份有限公司。

1.3 实验动物

清洁级昆明小鼠100 只6～8 周龄，雄性，体质量（32.8±2.35）g，哈尔滨医科大学实验动物学部提供，实验动物许可证号：SCXK（黑）2013-001。

基础鼠粮、高糖高脂鼠粮，青岛大任富城畜牧有限公司。高糖高脂鼠粮配方[15-16]：基础鼠粮54%、猪油20%、糖15%、蛋黄粉10%、胆固醇0.5%、胆酸钠0.5%。

1.4 试验方法

1.4.1 松仁稀碱提取物的制备[12]

原料预处理：将松仁粉碎后，采用石油醚脱脂、干燥，再次粉碎，过筛待用。

松仁稀碱提取物提取：准确称取按上述处理得到的脱脂松仁干粉60 g 加入0.01 mol/L NaOH溶液中浸提，料液比1∶45，提取温度40 ℃，超声提取时间35 min。提取液在3 000 r/min 条件下离心10 min，除去残渣，残渣再用蒸馏水提取（重复2次）；合并上清液，将溶液pH 值调为7.0 后进行减压浓缩，得到浓缩液，以苯酚硫酸法测定其多糖含量，分别稀释为低、中、高3 种设计浓度。1.4.2 糖尿病小鼠模型建立[17-18]小鼠饲养温度（23±2）℃，空气湿度适宜，12 h 明暗交替。先以基础鼠粮适应性喂养7 d，再随机分为2 组，第1 组10 只为正常对照组（NC），第2 组90 只为造模组。以基础鼠粮饲养第1 组，以高糖高脂鼠粮饲养第2 组。饲养5 周后，从第2 组中取出10 只作为高糖高脂对照组 （HC），其余小鼠禁食不禁水处理12～16 h，分别以柠檬酸-柠檬酸钠溶液缓冲液及柠檬酸-柠檬酸钠溶液缓冲液配制的1%STZ 进行腹腔注射，每次剂量为100 mg/kg，造2 型糖尿病小鼠模型，72 h 后禁食10 h 剪尾取血，以血糖仪测定小鼠空腹血糖值，对低于11.1 mmol/L 的小鼠进行小剂量补注射，72 h 后再测，以2 次均高于11.1 mmol/L 为造模成功。造模时间为1 周。

1.4.3 试验动物分组及处理 取造模成功的小鼠50 只，随机分为5 组，每组10 只，分别设为糖尿病模型组（DM）灌胃生理盐水、盐酸二甲双胍阳性药物组（PC）（166 mg/kg bw·d）、红松仁稀碱提物低、中、高剂量组（KPS-AE-L，KPS-AE-M，KPSAE-H）（分别为125，250，500 mg/kg bw·d），以上各组饲喂高糖高脂鼠粮。正常对照组（NC）、高糖高脂对照组（HC）均灌胃生理盐水，每天将受试样品按剂量给小鼠灌胃1 次，每次0.4 mL/只，自由进食和饮水，连续14 d。每天记录小鼠进食量及饮水量，每周称量小鼠体质量，观察小鼠状态。

1.4.4 摄食量及饮水量测定 每天分别定时按组投放定量的鼠粮和饮用水，次日记录剩余鼠粮质量和饮用水体积，公式为：

式中，m1——每天投放的鼠粮质量，g；V1——每天投放的饮用水体积，mL；m2——次日剩余的鼠粮质量，g；V2——次日剩余的饮用水体积，mL。1.4.5 空腹血糖（FBG）的测定[19]小鼠禁食不禁水12 h，采用剪尾采血法取小鼠尾尖血一滴，使用血糖仪及血糖试纸对小鼠进行血糖测定，重复2 次。本试验中，分别在灌胃受试药物的第0，7，14天测定空腹血糖值。

式中，FBG0——给药前空腹血糖值，mmol/L；FBG2——给药2 周结束后空腹血糖值，mmol/L。1.4.6 口服葡萄糖耐量（OGTT）测定[20-22]在小鼠末次给药前一天，禁食4 h，经口给予2.0 g/kg 葡萄糖溶液，于0，30，60，120 min 测定血糖值并记录，并根据公式计算各时间点血糖曲线下面积（AUC）：

式中，a，b，c，d——灌胃葡萄糖溶液0，30，60，120 min 后的血糖值，mmol/L。

1.4.7 试验后动物处理 试验周期为8 周，末次给药后禁食，宰杀当日称量体质量、空腹血糖值并记录，眼球取血法取全血，室温静置30 min，4 ℃冷藏静置3 h，离心分离血清，-80 ℃冷冻备用。

1.4.8 血清胰岛素测定[23-24]按试剂盒说明测定血清胰岛素含量并计算胰岛素敏感指数（ISI）及胰岛素分泌指数（FBCI）。

1.5 数据统计与分析

运用SPSS13.0 软件进行单因素方差分析（One Way ANOVA）与显著性检验，数据以平均数±标准差（±s）表示，P<0.05 则有显著性差异，有统计学意义，P<0.01 为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 松仁稀碱提取物对小鼠体质量的影响

建模前小鼠体质量为（32.8±2.35）g，基础鼠粮及高糖高脂鼠粮饲养的小鼠体质量均稳定增长，前两周高糖高脂组小鼠体质量升高最快，之后增长放缓，与普通鼠粮喂养组相比体质量差逐渐缩小，以致第5 周时体质量增加至约45 g 后，体质量处于较稳定状态，两组体质量相近，如图1a 所示。这可能与长期高脂喂养，影响小鼠食欲，摄食量有所减少有关，且小鼠体质量接近上限，增长也会放缓。另外，改变饮食初期，身体正常代谢水平还没有立即遭到破坏，在一段时间内仍然可以在一定程度上自行调节。然而，从体型上看高糖高脂喂养组体型略微显胖，体脂偏多，普通鼠粮喂养组体型匀称。从精神状态看，两组鼠均健康活跃，毛发顺滑。

各组小鼠给药期间体质量如图1b 所示，继续以高糖高脂饲料喂养的HC 组小鼠比普通鼠粮喂养的NC 组体质量差逐渐增大，在临宰杀前需要禁食，所以体质量下降，HC 组较NC 组下降更多，说明高脂鼠在饥饿时消耗更多脂肪来转化为能量。其它各组均为高糖高脂饲料喂养的糖尿病鼠，造模期间，非糖尿病鼠体质量仍在增长，注射STZ组小鼠体质量有所下降，开始治疗后阳性对照PC组对体质量稳定相对最好，其次为KPS-AE-H组，其它各组均比阴性对照DM 组好。

因此，高糖高脂饮食对糖脂代谢的紊乱在饮食改变初期虽未必体现，但长此以往将埋下隐患。各治疗组对糖尿病鼠的体质量控制有一定的改善作用，尤其后期，DM 组体质量下降更为明显，而治疗组则相对平稳。除PC 组外，KPS-AE-H 组表现更佳。另外，糖尿病模型小鼠一直饲喂高糖高脂饲料，KPS-AE 可能具有帮助减少多余脂肪的作用，这也会使体质量下降[25]。

图1 造模前、后小鼠体质量变化（±s，n=10）Fig.1 Body weight change of mice before and after modeling （±s，n=10）

2.2 松仁稀碱提取物对小鼠进食量和饮水量的影响

STZ 造模成功后，糖尿病小鼠均出现“三多一少”的典型症状，即饮水、进食、排尿量增多，体质量下降。如图2所示为试验期间每只小鼠每天的进食量与饮水量均值。DM 组、KPS-AE-L 组和KPS-AE-M 组进食量显著高于NC 组，而PC 组、KPS-AE-H 组与NC 组差异不显著，KPS-AE 治疗组在进食量方面普遍没有PC 组控制的理想。在饮水量方面，糖尿病患病组显著高于正常组，DM 组每只小鼠每天饮水约20 mL，而正常小鼠约为6 mL，前者为后者的3 倍还多。经二甲双胍及KPSAE 治疗，“三多一少”症状有所缓解，PC 组、KPSAE-M 组均显著低于DM 组，KPS-AE-M 组（13.03 mL/d）比DM 组（19.81 mL/d）降低了34%。

2.3 松仁稀碱提取物对小鼠空腹血糖的影响

血糖平衡取决于葡萄糖利用和肝脏葡萄糖输出之间的平衡，这是通过胰岛素敏感组织（肝脏、脂肪组织、骨骼肌）及不敏感组织调节的[4]。葡萄糖浓度通常在一个狭窄范围内波动，葡萄糖利用功能障碍，包括葡萄糖摄取、磷酸化，糖原的储存以及肝葡萄糖输出异常损害葡萄糖稳态，可能导致2 型糖尿病[26]。造模成功后小鼠空腹血糖值显著高于正常值，经过2 周灌胃KPS-AE，小鼠空腹血糖值均有所下降，明显低于高血糖模型组，结果见表1。

图2 对小鼠进食量和饮水量的影响Fig.2 Effect of food and water intake in mice

由表1可见，NC 组空腹血糖值始终正常且稳定，HC 组因摄食高糖高脂鼠粮空腹血糖值比NC组偏高，且稍有波动。灌胃前，DM 组及各治疗组血糖值差异不显著，然而极显著高于NC 及HC 对照组。灌胃1 周后，DM 组及各治疗组血糖呈上升趋势，可能由于以STZ 建立糖尿病模型，会选择性破坏小鼠胰岛β 细胞，使机体内胰岛素分泌不足，使血糖值持续稳定升高[27]，而各治疗组与DM组相比上升明显受到抑制。灌胃2 周后，DM 组空腹血糖值高达23.95 mmol/L，约为NC、HC 组的3倍，2 周后DM 组血糖升高了51.68%，而治疗组血糖值极显著低于DM 组，PC 组能抑制血糖的继续升高，灌胃2 周后血糖值基本控制在治疗前水平，KPS-AE 各剂量组降低空腹血糖的效果比PC 组优势更明显，其中KPS-AE-M 组效果最显著，降糖率达25.47%。

表1 小鼠空腹血糖值（±s，n=10）Table 1 Fasting blood glucose （FBG） of mice （±s，n=10）

表1 小鼠空腹血糖值（±s，n=10）Table 1 Fasting blood glucose （FBG） of mice （±s，n=10）

注：* 与NC 组相比差异显著（P＜0.05）；** 与NC 组相比差异极显著（P＜0.01）；#与DM 组相比差异显著（P＜0.05）；##与DM 组相比差异极显著（P＜0.01）；^ 与PC 组相比差异显著（P＜0.05）；^^ 与PC 组相比差异极显著（P＜0.01）。下同。

组别空腹血糖值/mmol·L-1灌胃前（FBG0） 灌胃1 周（FBG1） 灌胃2 周（FBG2）降糖率/%NC 7.15±0.90##^^ 7.45±0.89##^^ 7.06±1.78##^^ -HC 11.34±2.44*#^ 8.76±1.33##^^ 8.64±1.61##^^ -DM 15.79±5.95** 22.63±5.03** 23.95±4.95**^^ -51.68 PC 14.18±4.47** 19.74±4.30** 15.56±4.69**## -KPS-AE-L 13.90±2.86** 21.93±4.28** 12.08±5.33*## 13.09 KPS-AE-M 13.27±3.78** 16.30±5.36**# 9.89±3.09##^^ 25.47 KPS-AE-H 14.72±3.47** 23.70±5.69** 12.72±5.68**## 13.59

2.4 松仁稀碱提取物对小鼠口服葡萄糖耐受量的影响

口服葡萄糖耐量试验是一种葡萄糖负荷试验，用以了解胰岛β 细胞功能和机体对血糖的调节能力。正常情况下，进食糖类后血糖会暂时升高，0.5～1 h 后升到最高峰，2 h 后回到空腹水平。患有糖尿病或糖耐量异常者则不遵循此规律，出现血糖值升高及节律紊乱。OGTT 试验是诊断早期糖尿病和代谢性疾病的常用而有效的方法[28]。给药2 周结束，进行小鼠口服葡萄糖耐受量的测试，分别以0，30，60，120 min 的血糖值曲线及曲线下面积（AUC）来表示，结果见图3。

图3 小鼠口服葡萄糖耐量结果（±s，n=10）Fig.3 Results of oral glucose tolerance test of mice （±s，n=10）

图3a中空白组NC 在口服葡萄糖30 min 后血糖由7 升高至12.5 左右，在60 min 时接近口服前血糖水平，2 h 后恢复正常。而HC 组上升和下降均更缓慢，表现不及NC 组敏感。DM 组血糖最高，且在前1 h 一直在升高，之后呈缓慢下降。

图3b中可见糖尿病患病组AUC 面积均显著增加，KPS-AE-L 及KPS-AE-M 组与DM 组相比改善作用明显，而KPS-AE-H 组对葡萄糖耐受量改善情况不理想。在空腹血糖测试中灌胃KPSAE 的各组也有在第1 周血糖上升而第2 周缓解的现象，分析这可能与在灌胃KPS-AE 期间虽然利用葡萄糖的能力稍有改善，但还需要更长时间的治疗，2 周内每天灌胃多糖量偏大可能会引起血糖或葡萄糖耐量曲线下面积暂时性的升高，所以灌胃低中剂量已表现出葡萄糖耐受量的改善，而继续治疗一定周期，功能改善增强，可能会有不一样的效果，此推论还有待进一步证实。

2.5 松仁稀碱提取物对小鼠血清胰岛素的影响

血清胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素[29]。KPS-AE 对小鼠血清胰岛素的影响见表2。

胰岛素敏感指数（ISI）是临床检查胰岛素分泌的指标，用来评价胰岛素抵抗的程度，ISI 预测血浆葡萄糖浓度最初的升高，主要取决于肝脏胰岛素抵抗和内源性葡萄糖生成抑制，对葡萄糖诱导胰岛素释放做出反应[21]。

如表2所示，DM 组血清胰岛素浓度显著高于对照组，而其它各组与对照组相比则差异不显著。各治疗组与DM 组相比，胰岛素浓度均降低，PC及KPS-AE-L 组下降不明显，而KPS-AE-M 组及KPS-AE-H 组则分别呈显著降低及极显著降低结果。KPS-AE 各剂量组比PC 组更接近NC 组的血清胰岛素浓度，其中KPS-AE-H 组与PC 组相比效果最明显。由此说明KPS-AE 能够有效提高胰岛素分泌量。

表2中各患病组除KPS-AE-M 组外其它各组的胰岛素敏感指数 （ISI） 均比NC、HC 对照组低，且差异极显著，其中DM 组最低，与NC 组相比降低超过50%，KPS-AE 各剂量组效果好于PC组，可见KPS-AE 能够增强胰岛素敏感性，其中KPS-AE-M 效果最佳。

表2 KPS-AE 对小鼠血清胰岛素的影响Table 2 Effect of KPS-AE on serum insulin in mice

与对照组相比各患病组胰岛素分泌指数显著下降，DM 组分泌指数最低，仅为NC 组的31%，各治疗组中，KPS-AE 各剂量组结果均高于PC 组，其中KPS-AE-M 组降低幅度最小，说明KPS-AEM 组胰岛素分泌量最接近对照组，可能具有抑制胰岛细胞凋亡，恢复胰腺损伤，保护胰岛β 细胞，促进胰岛素的分泌，从而帮助稳定血糖水平，减小血糖波动范围，发挥对高血糖的辅助调节作用[30]。

3 讨论

在生物活性成分降血糖研究中，STZ 诱导的糖尿病大鼠模型最为常用。通过少量多次腹腔注射STZ 容易诱导产生2 型糖尿病。STZ 可在大鼠体内产生过量自由基使β 细胞功能受损，胰岛素合成减少，从而引发糖尿病[31]。使用胰岛素和口服降血糖药物治疗糖尿病虽然效果直接，但是临床应用中往往伴随低血糖，肝脏受损等副作用。与其它研究中阴性对照组小鼠状态类似[32]，DM 组小鼠皮毛暗淡无光，身体瘦弱，动作迟缓，饮水量、摄食量和排尿量均增加。在本研究中采用二甲双胍作为阳性对照药品，能够缓解糖尿病小鼠多饮、多食，肌体消瘦的状况，综合来看没有KPS-AE-M组效果更为理想。推测与红松松仁富含蛋白质、多糖及多种维生素和矿物质在小鼠体内发挥生物活性有关。已有研究报道表明，植物来源生物活性蛋白肽，如被称为植物胰岛素的苦瓜多肽及人参多肽、灵芝多肽[33]，还有多糖类，如南瓜多糖、食用菌多糖等均有较好的降血糖效果[34-35]，且某些碱提酸性多糖在特定生物功能方面优于酸提及水提多糖[36]。另有研究表明松仁具有降血脂，增强免疫力的功效，也可以起到调节糖脂代谢，辅助治疗糖尿病的作用[10，12]。

空腹血糖往往被认为是诊断糖尿病的常规指标，与口服葡萄糖耐受量试验及血清胰岛素、胰岛素敏感指数相结合可反映机体对血糖的调节能力，胰岛β 细胞功能和对胰岛素的敏感性。本试验中用药一周还不足以发挥治疗作用，所以血糖出现暂时性波动，在治疗2 周后表现出降低血糖，改善口服葡萄糖耐量及血清胰岛素的功效。一些研究表明糖尿病鼠胰岛功能受损，胰岛素分泌能力会下降，在本试验中虽然糖尿病小鼠DM 组血清胰岛素比正常组还稍高，但胰岛素敏感指数及分泌指数还是偏低，即并不足以分泌足量胰岛素以调整糖尿病鼠的高血糖状况，表明其胰岛素分泌相对不足。也有研究表明，苦瓜、大豆都可以作为促胰岛素分泌的食物，而亚麻籽、黄葵种子、荞麦粉、甘薯可以增加胰岛素敏感性[37-41]。

综上所述，本试验对红松松仁稀碱提取物的降血糖功能进行了体内验证，结果表明红松松仁稀碱提取物对糖尿病小鼠患病期间体质量下降，多饮、多食症状有一定的控制作用，可以明显降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，改善小鼠口服葡萄糖耐受量，可以保护恢复胰腺功能，提高小鼠胰岛素分泌能力及敏感指数。表明红松松仁稀碱提取物有开发成为抗糖尿病功能性产品的潜力，其具体作用机理还有待深入研究。