天然植物精油对枯草芽孢杆菌的抑制作用

王叶青 丁慧璞 徐 旭 程 丹 王志江 刘利萍*

（1 浙江万里学院生物与环境学院 浙江宁波315100 2 宁波大央工贸有限公司 浙江宁波315000 3 浙江医药高等专科学校制药工程学院 浙江宁波315100）

精油也称挥发油，是一类存在于植物体中有芳香气味，在常温下能挥发，可随水蒸气蒸馏出的油状液体的总称。广泛应用于化妆品、香料以及医药工业[1]。许多天然植物精油有抑菌或杀死微生物的特性[2-4]。梅林等[5]测定了八角茴香精油对痢疾杆菌、金葡菌、白喉杆菌、伤寒杆菌的MIC 值，显示八角茴香精油对这些微生物有较强的抑制作用。秦文文[6]研究了茶树精油对5 种供试菌抑菌效果均属于中度敏感，测得大肠埃希菌和白色葡萄球菌的MIC 为1.0%，金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的MIC 分别为1.2%，1.4%，2.0%。黄妙玲等[7]研究了金盏花精油对皮肤有很好的抗炎及促进细胞再生作用，对青春痘、皮肤疤痕等都有治疗效果。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，芽孢是产芽孢细菌生长发育后期菌体内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、折光性强、具抗逆性的休眠体，它有惊人的耐高温能力和抗辐射能力。由于芽孢杆菌能产生很强抗逆性的芽孢，因此是在食品工业中经常遇到的污染菌，它们可以引起果蔬、粮食、乳制品、肉类、鱼类、禽类、蛋类以及罐头食品变质，导致一些食源性疾病和食物中毒[8]。

在食品工业生产中，长期使用山梨酸钾、苯甲酸钠等人工合成食品防腐剂。现已发现，它们对食品的口感及人体健康有不良影响，因此要求严格限制其在食品中的用量[9]。开发高效、安全、稳定且廉价的新型防腐剂，具有重要意义。天然防腐剂的研究和开发利用成为当今食品工业的一个热点[10]。天然防腐剂对人体健康无害，有些天然防腐剂已达到或超过人工合成防腐剂的效果。

本试验选择自然界常见的8 种植物精油测定其对枯草芽孢杆菌的抑制活性，并筛选出其中对枯草芽孢杆菌抑制效果较好的植物精油，测定其最低抑菌浓度，按照最低抑菌浓度复配植物精油，利用其协同增效作用以达到更好的抑菌效果。对复配植物精油的机理进行探究，为植物精油在食品中的应用提供理论基础，为天然防腐剂在食品贮藏保鲜中的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物精油：菊花精油、冬青精油、金盏花精油、八角茴香精油、香蜂草精油、佛手柑精油、茉莉精油和野番茄精油，通过水蒸气蒸馏法制得，于低温4 ℃避光保存。均由宁波大央工贸有限公司提供。

尼泊金乙酯 （配制质量浓度为50 μg/mL 使用），国药集团。

供试菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），于-20 ℃，斜面保存，由浙江万里学院微生物实验室惠赠。

1.2 微生物培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：用于细菌培养。牛肉膏3 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，琼脂1.5～2.0 g（液体培养基不含琼脂），水100 mL，pH 7.0～7.2（使用1.0 mol/L NaOH 溶液调pH 值）。

1.3 仪器与设备

SW-CJ-2FD 型净化工作台，苏州净化设备有限公司；YXQ-75SII 型压力蒸汽灭菌器、BSP-150型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备；SKY-200B 恒温培养振荡器，上海苏坤实业有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 供试菌悬液制备 从活化的菌体斜面上挑取菌体接种于相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱中培养至对数生长期。分别吸取供试菌液0.5 mL，加入无菌水倍比稀释到105～106CFU/mL，备用。

1.4.2 8种植物精油对枯草芽孢杆菌的抑制活性取6 支50 mL 锥形瓶（编号1～6），1 号瓶中加入20 mL 培养基为空白；6 号瓶中加入10 mL 培养基与10 mL 菌悬液为阴性对照；2～5 号瓶中加入10 mL 菌悬液，再依次加入2.0，5.0，10，20 μL 植物精油，再加入培养液至20 mL。置于37 ℃培养24 h。培养结束后，观察培养液，如出现浑浊，表明有菌生长；澄清透明，表明加入的精油有抑菌作用[11]。

1.4.3 最低抑菌浓度（MIC）测定 选取1.4.2 节中抑菌效果好的植物精油，采用倍比稀释法测定其MIC。取9 支50 mL 锥形瓶（编号1～9），1 号瓶中加入20 mL 培养基为空白；9 号瓶中加入10 mL 培养基与10 mL 菌悬液为阴性对照；2～8 号瓶中加入10 mL 菌悬液，再依次加入1.25，2.5，5.0，10，20，40，50 μL 植物精油，同时以同剂量的50 μg/mL 尼泊金乙酯作阳性对照，再加入培养基至20 mL。置于37 ℃培养24 h。培养结束后，测定各试管中培养液在600 nm 波长处的透光率（细菌在一定条件下，可以在其相应的液体培养基中生长并能够使培养基变浑浊，如果在其中加入具有抑菌效果的植物精油，则能使培养基保持澄清透明）。在透光率40%～60%范围内，确定对应试管的植物精油浓度为对应菌种的最低抑菌浓度。

分别取这4 种植物精油MIC 下的菌液200 μL 于固体培养基中涂布，放入恒温培养箱中培养（24 h，37 ℃），观察枯草芽孢杆菌的生长情况。

1.4.4 复配植物精油对枯草芽孢杆菌的抑制性选出1.4.2 节中抑菌效果较好的菊花精油、八角茴香精油、金盏花精油及冬青精油为因变量，MIC 为各因素的最高水平，以菌液的透光率为响应值，做Box-Behnken 响应面优化试验，按照1.4.3 节的方法测定复配精油的抑菌活性，确定菊花精油、八角茴香精油、金盏花精油以及冬青精油的最佳组合。

1.4.5 复配精油对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响 将枯草芽孢杆菌培养至对数生长期，取出部分菌液，并分为对照组和复配精油试验组。对照组是将菌液直接用相应的液体培养基稀释到菌体个数为105～106CFU/mL；复配精油试验组是将菌液加到含复配精油浓度为最佳配方的液体培养基中，并使得菌体个数为105～106CFU/mL。将对照组和复配精油组继续培养，每隔2 h 取样，离心收集菌体，重悬于2 mL 生理盐水中测A600nm值，制作对照组生长曲线和复配精油试验组生长曲线[12]，分析复配精油的抑菌特性。

2 结果与分析

2.1 8 种植物精油抑菌活性的测定结果

当精油含量在1 μL/mL 内，8 种植物精油对枯草芽孢杆菌均表现出不同程度的抑制效果，依次为：八角茴香精油＞菊花精油、金盏花精油＞冬青精油＞茉莉精油、佛手柑精油＞香蜂草精油、野番茄精油。

表1 8 种植物精油对枯草芽孢杆菌的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of eight plant essential oils against the Bacillus subtilis

2.2 4 种植物精油最低抑菌浓度（MIC）测定结果

根据2.1 节的试验结果，选取其中4 种对枯草芽孢杆菌抑制活性效果较好的精油，测定其最低抑菌浓度。

由表2可知，这4 种植物精油对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别是八角茴香（0.25 μL/mL）＞金盏花（0.5 μL/mL）≈菊花（0.5 μL/mL）＞冬青精油（1.0 μL/mL），其中八角茴香精油的抑菌性比阳性对照尼泊金酯还强，小于尼泊金酯的MIC 值为0.5 μL/mL。

这4 种植物精油在MIC 下对枯草芽孢杆菌都有很好的抑制作用，金盏花精油、菊花精油和冬青精油在MIC 时，杀死了绝大多数枯草芽孢杆菌及其芽孢，而八角茴香精油在MIC 时，枯草芽孢杆菌及其产生的芽孢都被杀死。

2.3 复配植物精油抑菌活性测定结果

根据表4得到植物精油复配对枯草芽孢杆菌生长（透光率）影响规律的二次多项拟合方程为：

透光率（%）=86.17+5.64A+10.72B+9.58C+12.34D-4.35AB+4.39AC+5.33AD-8.53BC-1.40BD-4.28CD+0.91A2-7.58B2-11.56C2-10.67D2，R2=0.9544。

所建立的回归模型P＜0.001，说明模型极显著。A，B，C，D，BC 的P＜0.05，说明菊花精油（B）、八角茴香精油（D）、金盏花精油（C）、冬青精油（A），以及菊花精油和金盏花精油复配（BC）对枯草芽孢杆菌的生长抑制有显著影响。其影响大小次序为：菊花精油（B）、八角茴香精油（D）>金盏花精油（C）>冬青精油（A）>菊花精油和金盏花精油复配（BC）。从试验数据和统计学分析可知，菊花精油和金盏花精油存在相互作用，两种精油复配有相互增效作用。

图2表示冬青精油0.5 μL/mL 和八角茴香精油0.13 μL/mL 时，菊花精油和金盏花精油对透光率的响应面影响。菊花精油和金盏花精油对枯草芽孢杆菌的生长抑制存在显著协同增效作用，且随着菊花精油和金盏花精油浓度的升高对枯草芽孢杆菌的抑制作用变强，当浓度达到一定时趋于平稳。

通过软件Design-Expert 8.0.6 分析得枯草芽孢杆菌生长抑制的最佳条件是：冬青精油为0.61 μL/mL、菊花精油为0.44 μL/mL、金盏花精油为0.24 μL/mL、八角茴香精油为0.17 μL/mL 时，透光率预测最大值为93.45%。按照上述配方，进行3次重复试验，测定得到透光率的平均值为91.05%±1.81%（91.31%，93.24%，89.7%），与预测值接近，说明此响应面法得到的回归模型可靠。

表2 4 种植物精油的最低抑菌浓度（MIC）Table 2 Minimum inhibitory concentration （MIC） of four kinds of essential oils

图1 4 种植物精油在MIC 时枯草芽孢杆菌的生长情况Fig.1 The growth of Bacillus subtilis at MIC of four kinds of essential oils

表3 4 种植物精油复配的响应面抑菌试验结果Table 3 Response surface test results of four kinds of essential oils complexed

表4 方差分析表Table 4 Variance analyses

图2 菊花精油和金盏花精油对枯草芽孢杆菌的响应面分析Fig.2 Response surface analysis of chrysanthemum essential oil and calendula essential oil to Bacillus subtilis

2.4 复配精油对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响

按照2.3 节得到的抑制枯草芽孢杆菌生长的最佳精油配方进行复配，冬青精油为0.61 μL/mL，菊花精油为0.44 μL/mL，金盏花精油为0.24 μL/mL，八角茴香精油为0.17 μL/mL，研究复配植物精油对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响。

由图3可知，经复配精油处理过的枯草芽孢杆菌菌种生长情况与对照组相比较，生长缓慢，最终的菌体量不及正常生长量的一半。精油复配表现出对微生物生长抑制的协同增效作用，这与韩军等[11]研究的肉桂、大蒜、丁香花蕾和生姜精油复配后对单核增生李斯特氏菌的抑菌增效一致。

图3 复配精油对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响Fig.3 The effect of compound essential oil on growth curve of Bacillus subtilis

从图3可以判断复配精油主要抑制了枯草芽孢杆菌对数生长期的分裂和繁殖，使得活菌数明显下降，无法达到正常的生长高峰，并且很快进入衰亡期。

3 结论

开发植物性抑菌剂已成为当前食品保鲜的一个热点。本试验从8 种植物精油中筛选出了对抗逆性极强的枯草芽孢杆菌有抑菌效果的4 种植物精油，分别是金盏花精油、菊花精油、冬青精油和八角茴香精油，这4 种植物精油对枯草芽孢杆菌的MIC 值显示，八角茴香精油的抗菌性强于阳性对照尼泊金酯。通过响应面试验发现当冬青精油0.5 μL/mL、八角茴香精油0.13 μL/mL 时，菊花精油和金盏花精油对枯草芽孢杆菌存在协同增效作用；对枯草芽孢杆菌抑菌效果最好的复配精油比例为冬青精油0.61 μL/mL+菊花精油0.44 μL/mL+金盏花精油0.24 μL/mL+八角茴香精油0.17 μL/mL 时，复配精油能有效抑制枯草芽孢杆菌数的生长，其透光率达到91.05%±1.81%。本研究为天然防腐剂的研究提供了一个新的思路，可以利用植物精油经过可行性加工，生产一种能用作于食品保藏、防腐的天然无毒的生物防腐剂，这对植物精油的进一步开发利用有一定的意义。