紫菜对大鼠生理机能及体内铅含量的影响

江艳华 顾晓慧，3 郭莹莹 朱文嘉 姚 琳 刘占涛 高 华 王联珠*

（1 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室山东青岛266071 2 青岛大学医学院 山东青岛266021 3 威海海洋职业学院食品工程系 山东威海264300）

紫菜（Pyropia），属于红藻纲、红毛菜科，是世界重要的经济藻类之一。我国的紫菜产量位居世界第一，2018年养殖产量达到20.18 万t，其中主要品种有条斑紫菜 （P.yezoensis） 和坛紫菜（P.haitanensis）[1]。条斑紫菜是国际贸易流通的主要品种，在亚洲尤其在我国、日本和韩国有大规模养殖，我国的主产区为江苏省，是出口的主要品种。坛紫菜是我国特有的养殖品种，主产区为浙江和福建省，约占我国紫菜总产量的75%，占世界紫菜产量的50%以上[2]。紫菜富含蛋白质、氨基酸、多糖、不饱和脂肪酸、维生素、微量元素等，具有很高的营养价值，还具有抗氧化，抗肿瘤，抗衰老，免疫调节等功效，在食品、药品及化妆品等方面具有巨大的开发利用价值[3-5]。

近年来，紫菜的安全性受到社会各界的广泛关注，其中重金属超标问题尤为严重。紫菜由于特殊的生理特性及生活环境，极易富集水体中的重金属，造成藻体中重金属含量较高，因重金属超标造成产品不合格，给很多企业带来困扰[6]。然而，关于紫菜重金属的安全性仍然没有定论，国外也未对紫菜的重金属限量进行规定。2011年7月召开的第35 届国际食品法典委员会（Codex alimentarius commission，CAC）年会作出了以韩国为主，中、日、韩三国共同制定CAC《紫菜产品区域标准》的决定，紫菜的质量安全进一步引起政府部门的高度关注[2]。目前，该标准已发布，虽然未对重金属限量做出规定，但在标准制定过程中一直存在很大争议。基于这些背景，本文采用30 d 喂养试验，探讨条斑紫菜和坛紫菜对大鼠体质量、肝肾功能和抗氧化系统的影响，并以铅为例，探讨紫菜中的铅在各器官组织中的蓄积情况，为紫菜的食用安全性评估提供一定的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

条斑紫菜采集自江苏连云港，坛紫菜采集自福建晋江。紫菜经80 ℃烘干至恒重，过80 目筛，于干燥器中保存备用。实验前将紫菜溶于西黄蓍胶助悬剂中，分别制成50，30，10 mg/mL 的混悬液。

Wistar 大鼠，清洁级，体质量（220±20）g，雌雄各半，山东省鲁抗医药股份有限公司。

西黄蓍胶、硝酸、高氯酸、乙酸铅（Pb（CH3COO）2·3H2O），国药集团化学试剂有限公司；乌拉坦，北京普博斯生物科技有限公司；铅标准溶液，中国标准物质中心；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；总蛋白（TP）检测试剂盒、碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（二乙醇胺法）、谷草转氨酶（AST）检测试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）检测试剂盒、尿素氮（BUN） 检测试剂盒、肌酐（Cr）检测试剂盒，德赛诊断系统（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

全谱直读等离子体发射光谱仪Optima 5300DV，美国PerkinElmer 公司；多功能快速消化器LNK-872，江苏宜兴科教仪器研究所；紫外可见分光光度计UV-3600，日本岛津公司；全自动生化分析仪CS-800B，长春迪瑞实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 动物实验 大鼠运送至实验室后进行适应性饲养7 d，观察无异常情况后按体质量随机分为7 组，每组8 只，雌雄各半，分别记为A，B，C，D，E，F，G 组。其中A 组为空白对照组（生理盐水），B 组为条斑紫菜高剂量组【500 mg/（kg bw·d）】，C 组为条斑紫菜中剂量组【300 mg/（kg bw·d）】、D 组为条斑紫菜低剂量组【100 mg/（kg bw·d）】，E 组为坛紫菜高剂量组【500 mg/（kg bw·d）】，F 组为坛紫菜中剂量组【300 mg/（kg bw·d）】、G 组为坛紫菜低剂量组【100 mg/（kg bw·d）】。实验组（B～G 组）大鼠除了正常进食饲料及饮水外，每天灌胃紫菜样品，连续灌胃30 d，空白对照（A 组）灌胃等体积的生理盐水。实验期间，每天观察和记录大鼠一般表现、行为、中毒或死亡情况，每周对大鼠称重一次，以调整灌胃量。所有实验动物进食低铅饲料（实测铅含量小于0.003 mg/kg），饲养温度为20～25 ℃，湿度为40%～70%，人工昼夜为12 h/12 h。

灌胃30 d 后，称取体质量，对大鼠禁食（不禁水）12 h，以4 mL/kg bw 的剂量注射25%乌拉坦麻醉大鼠，由腹主动脉取血，一部分用于测定全血的铅含量，一部分用于分离血清。将用于分离血清的血液在室温下静置1～2 h，于4 ℃下3 000 r/min 离心15 min，分离血清，用于生化指标的测定。摘取大鼠肝脏和肾脏，称重，收集粪便并冻干，所有样品及时置于-80 ℃下保存备用。

1.3.2 生化指标测定 采用商品化试剂盒测定血清中的SOD 和GSH-Px 的活力。采用商品化试剂盒结合生化分析仪测定血清中的肝功能指标TP、ALP、AST、ALT 以及肾功能指标BUN、Cr 的含量（或活力）。

1.3.3 铅含量的测定 采用硝酸和高氯酸对大鼠肝、肾、血液、粪便样品进行湿法消化，用全谱直读等离子体发射光谱仪（ICP-AES）进行测定[7]。仪器测定波长：220.353 nm；观测方式：轴向；射频功率：1 300 W；观测高度：工作线圈以上15.0 mm；等离子气流量（氩气）：15 L/min；辅助气流量（氩气）：0.2 L/min；雾化器流量（氩气）：0.8 L/min。

1.4 数据处理

大鼠体质量增长率=（大鼠最终体质量-大鼠初始体质量）/大鼠初始体质量×100%。肝（肾）的相对质量= 肝（肾）质量/大鼠体质量×100%。数据采用统计软件SPSS 18.0 进行分析，结果以8 只大鼠的平均值±标准差表示，各组之间数据的统计学比较采用t-检验法，P＜0.05 表示具有显著性差异，P＜0.01 表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 紫菜对大鼠体质量及脏器质量的影响

条斑紫菜和坛紫菜对大鼠体质量的影响结果见表1。在灌胃实验期间，在第14 天时坛紫菜处理组的大鼠体质量增长率与空白对照组持平，其余时间点下条斑紫菜和坛紫菜处理组的大鼠体质量增长率均高于空白对照组，表明紫菜能促进大鼠生长，然而各组之间没有显著性差异（P＞0.05）。结果表明紫菜对大鼠生长发育没有显著影响。

2.2 紫菜对大鼠肝肾质量及肝肾系数的影响

紫菜对大鼠肝肾质量及肝肾系数的影响结果见表2，喂养条斑紫菜和坛紫菜的各组大鼠的肝肾绝对质量和肝肾系数均与空白对照组无显著性差异（P＞0.05），说明条斑紫菜和坛紫菜对肝肾质量和肝肾系数无影响。

表1 紫菜对大鼠体质量的影响Table 1 Effects of laver on body mass of rats

表2 紫菜对大鼠肝肾质量及肝肾系数的影响Table 2 Effects of laver on liver and kidney mass and their coefficients of rats

2.3 紫菜对大鼠肝功能的影响

紫菜对大鼠肝功能指标TP、ALP、AST 和ALT的影响结果如表3所示，喂食条斑紫菜和坛紫菜的大鼠，各项肝脏生化指标与空白对照组之间无显著性差异（P>0.05），说明在生理生化水平上紫菜能够维持肝脏的正常功能。

表3 紫菜对大鼠肝功能的影响Table 3 Effects of laver on liver function of rats

2.4 紫菜对大鼠肾功能的影响

紫菜对大鼠肾功能指标BUN 和Cr 的影响结果见表4，各紫菜剂量组的BUN 含量和Cr 含量与空白对照组间均未呈现显著性差异 （P>0.05），各剂量组间无显著性差异（P>0.05）。结果表明紫菜能够在生理生化水平上维持大鼠正常的肾脏功能。

2.5 紫菜对大鼠抗氧化系统的影响

SOD 和GSH-Px 是机体抗氧化损伤防御体系中最重要的两种抗氧化酶。结果如表5所示，所有剂量的坛紫菜均能显著提高大鼠SOD 的活力（P＜0.05），中剂量和高剂量的坛紫菜能极显著提高大鼠GSH-Px 的活力（P＜0.01），坛紫菜摄入量越高，SOD、GSH-Px 的活力越高，呈现一定的量效关系。条斑紫菜处理后，大鼠的SOD 和GSH-Px活力略有升高，而变化不显著（P＞0.05）。

表4 紫菜对大鼠肾功能的影响Table 4 Effects of laver on renal function of rats

表5 紫菜对大鼠抗氧化系统的影响Table 5 Effects of laver on antioxidant defense system of rats

2.6 紫菜对大鼠体内铅含量的影响

经过测定，本试验用的条斑紫菜和坛紫菜样品中铅含量分别为1.332 mg/kg 和2.451 mg/kg。以含铅的紫菜喂食大鼠后，大鼠体内肝肾、血液及粪便中铅含量的变化见表6。结果显示，大鼠肝脏和肾脏的铅含量并未受到紫菜的影响，各剂量组与空白对照组间无显著性差异（P＞0.05），表明紫菜中的铅并未在大鼠肝脏和肾脏中蓄积。条斑紫菜低剂量组和坛紫菜高、中、低剂量组中大鼠的血铅含量显著高于空白对照组（P＜0.01），条斑紫菜高、中、低剂量组中大鼠的粪铅含量显著高于空白对照组（P＜0.01）。从血液和粪便中铅含量的数值来看，当粪便中铅含量高时，对应的血液中铅含量则较低，表明条斑紫菜中的铅更易随粪便排出动物体外，减少在体内的蓄积。

3 讨论

本研究以条斑紫菜和坛紫菜为研究对象，基于中国人均体重60 kg、人均每日紫菜摄入量2～10 张（或6～30 g）的量，设置3 个剂量，分别为500，300，100 mg/（kg bw·d），进行30 d 喂养实验。通过对大鼠的生长情况、肝肾功能、抗氧化系统功能以及各组织和粪便中铅含量等指标的测定，初步探讨紫菜的食用价值及安全性。

实验期间，各组大鼠发育良好，被毛浓密有光泽，活动正常、较活跃，均未出现死亡和异常现象。体重是反映生物体健康状况的一项重要指标，实验期间各剂量组大鼠的体质量呈逐渐增长的趋势，灌胃条斑紫菜和坛紫菜的大鼠体质量增长更快，尽管与空白对照组无显著性差异，还是反应出紫菜的促生长作用。条斑紫菜和坛紫菜含有丰富的氨基酸，必需氨基酸含量高达40%左右，其组成比例与世界粮农组织（FAO）发布的人类必需氨基酸的理想模式相似，同时富含各种维生素、胆碱、钙和铁等微量元素，因而能够促进生物体的生长和发育[8]。

表6 紫菜对大鼠体内铅含量的影响Table 6 Effects of laver on content of lead in organs of rats

当食物经过消化道进入人体后，通过血液输送到机体各个组织，肝脏和肾脏是生物体进行物质代谢和毒物蓄积的重要器官。如果摄入的食物中含有有毒物质，肝脏和肾脏就有可能出现不同程度的损伤，肝肾损伤可能引起细胞肿胀、增生，使脏器系数增高，也可因肝肾细胞坏死吸收，血液供应减少，导致肝肾萎缩，使脏器系数降低[9]。当肝功能受损，出现代谢紊乱，肝脏中各种酶类大量溢出进入血液，使血清中酶活性升高，这些酶主要包括TP、ALP、AST 和ALT 等，是诊断肝脏损伤的主要监测指标[10]。当肾脏功能受损，机体内含氮化合物的代谢水平受到影响，导致体内BUN 和Cr 浓度升高[11]。本实验对大鼠喂食紫菜后，大鼠的肝脏、肾脏质量以及肝脏系数、肾脏系数、肝肾功能指示指标等与空白对照无显著性差异，也无明显的量效关系，解剖时，各组大鼠内脏等均未发现异常，表明紫菜对大鼠没有明显毒性作用。

当有毒物质进入机体，在代谢过程中会产生自由基，如超氧阴离子、羟基、过氧化氢等，造成机体的脂质氧化和一些重要酶类的氧化，从而导致机体损伤[12]。抗氧化酶是机体对抗氧化损伤的第一道防线，SOD 和GSH-Px 是机体重要的两种抗氧化酶，SOD 能清除超氧阴离子，GSH-Px 能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2分解，从而保护细胞免受损伤[13-14]。本试验发现，坛紫菜能显著提高大鼠SOD 和GSH-Px 的活力，且与摄入紫菜呈量效关系，表明坛紫菜具有显著提高生物体抗氧化防御能力。

紫菜由于特殊的生理特性及生活环境，极易富集水体中的重金属，造成藻体中重金属含量较高。我国GB 2762-2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定藻类中铅最高限量为1.0 mg/kg （以干重计）[15]，依据该标准，紫菜产品的铅含量极易超标，造成产品下架，给很多企业带来困扰。目前CAC、日本、韩国、美国、欧盟均未对紫菜中铅的限量进行规定，在制定CAC《紫菜产品区域标准》时，日本也认为不必要规定重金属限量，而我国规定紫菜等藻类的铅限量为1.0 mg/kg，该限量是否过于严格需要进行科学地评估。

本实验的条斑紫菜和坛紫菜样品铅含量分别为1.332 mg/kg 和2.451 mg/kg，该数值已经超过我国GB 2762-2017 《食品安全国家标准 食品中污染物限量》的相关规定。铅是一种蓄积性极强的污染物，主要通过消化道和呼吸道进入生物体，经口摄入的铅主要分布在血液、肾脏和肝脏中，较长时间的染毒会于骨骼蓄积，从而破坏器官和组织正常结构和生理功能。张建平等[16]采用稳定同位素示踪技术发现铅在大鼠体内主要蓄积在肝肾中。在本实验中，大鼠肝脏和肾脏的铅含量并未受到紫菜的影响，表明紫菜中的铅并未在大鼠肝脏和肾脏中蓄积。而大鼠血液中的铅含量与粪便中铅含量呈一定反比关系，当粪便中铅含量高时，对应的血液中铅含量则较低，其中条斑紫菜中的铅更易随粪便排出动物体外。紫菜含有活性多糖等物质，表面含有较多的活性基团且带有一定的负电荷，对重金属具有较强的吸附作用[6]，虽然紫菜中的铅含量较高，但是进入机体后，铅有可能随着紫菜的螯合作用最后排出体外，并未在体内造成蓄积。尽管本实验发现摄入坛紫菜的大鼠血液中铅含量明显高于空白对照组，但这并不能表明坛紫菜中的铅具有毒性作用，从实验结果来看，坛紫菜并未造成大鼠中毒效应，而且从抗氧化作用来看，坛紫菜能提高大鼠机体的抗氧化防御功能，这在抵御重金属中毒效应中具有重要意义。

1993年联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）食品添加剂联合专家委员会（JECFA）推荐的人体每周可耐受铅摄入量（PTWIs） 为0.025 mg/kg bw[17]，则我国成年人按60 kg 标准体重计算每天可耐受摄入量为0.214 mg。虽然因各国实际铅摄入量达到引起儿童智商损害和成人收缩压升高的程度，JECFA 取消了PTWIs 值[18]，但目前很多文献仍以该值作为评估的重要依据。本实验用的紫菜样品按人均每日摄入量6～30 g 计，则从条斑紫菜摄入的铅为0.008～0.040 mg，占可耐受摄入量的3.74%～18.69%；从坛紫菜摄入的铅为0.015～0.074 mg，占可耐受摄入量的7.01%～34.58%。虽然缺少紫菜的膳食调查数据，但根据我国人群的饮食习惯，紫菜在消费食物中的占比很小，人均每日摄入量要远低于6 g，从紫菜摄入的铅仅占可耐受摄入量的极小部分，可以说是比较安全的。

综上所述，本研究以条斑紫菜和坛紫菜为研究对象，从动物实验的角度出发对其食用安全性进行了初步评价，结果表明紫菜能够维持大鼠正常的生理机能，尤其是坛紫菜能够明显增强抗氧化能力，对生物体健康具有良好的功效，紫菜中的铅未在肝肾等靶器官中蓄积。至于紫菜中重金属的安全性则需要通过分离和鉴定紫菜中不同形态和不同结合态重金属的毒性来做进一步科学评估。