加味苓桂术甘汤对非酒精性脂肪肝大鼠AdipoR-2、PPARα表达的影响

赵兴旺 潘丰满 卢文艺 黄江荣 刘莲 黄蔚 黄祥武

(长江大学 1医学部，湖北 荆州 434023;2第三临床医学院内分泌科)

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化〔1〕。近年来，随着人们生活水平的不断提高，NAFLD的发病率和检出率逐年增加，普通成人患病率达20%～33%〔2〕。本研究探讨加味苓桂术甘汤(RLZD)对高脂高糖饮食建立的NAFLD大鼠肝脏组织病理及脂代谢相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3周龄Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重50～70 g，购自湖北省实验动物研究中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 药物与试剂 茯苓12 g、桂枝9 g、白术12 g、党参12 g、法半夏12 g、生山楂30 g、豨莶草15 g、红花9 g、川芎9 g、制首乌15 g、甘草6 g，由荆州市中医医院中药制剂室制备成浓度为0.6 g/ml的RLZD煎液；阿托伐他汀(批号H19990258)购自北京嘉林药业；SYBR实时定量试剂(批号AK3203)购自Takara公司；逆转录试剂盒(批号AK2303)购自Takara公司；Trizol试剂盒(批号66206)购自Invitrogen公司。

1.3 分组与给药 60只Wistar 大鼠适应喂养1 w后，随机分为正常组、模型组、阿托伐他汀组、RLZD高、中、低剂量组，每组10只。除对照组外，给予高脂高糖饲料喂养(基础饲料50%，猪油25%，蔗糖15%，氯化钠10%)〔3〕，高脂高糖饲料由长江大学医学部动物实验中心配制，连续喂养12 w。正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续12 w。

1.4 标本采集与肝脏病理组织学观察 大鼠称重后乙醚麻醉，用卷尺测定大鼠鼻尖到肛门长度为体长，计算Lee指数，Lee指数(g/cm)=〔体重1/3×1 000/体长〕。颈动脉取血处死动物，于冰上取肝脏，并在冰冷的生理盐水中洗去表面血水后用吸水纸除去表面水滴，称取肝重，肝脏指数=肝脏重量/体重×100%。取肝中叶做病理组织学检查，4%多聚甲醛中固定，脱水包埋后做石蜡切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下照相观察。余下肝组织用锡纸包裹，置于-80℃保存备用。

1.5 脂联素受体(AdipoR)-2及过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)α基因表达的检测 取肝组织(75±5)mg，使用Trizol法提取总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，聚合酶链反应(PCR)扩增所用引物(表1)，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司设计提供。检测各引物的特异性，采用实时荧光(RT)-PCR法检测各基因的表达水平。

表1 各基因的引物序列及片段大小

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1 大鼠体重、肝重、肝脏指数及Lee指数比较 与正常组比较，模型组大鼠体重、肝重、肝脏指数及Lee指数显著增高(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，RLZD高、中剂量组、阿托伐他汀组大鼠体重、肝重、肝脏指数、Lee指数显著降低(P<0.05，P<0.01)，RLZD低剂量组大鼠体重、肝重、Lee指数也显著降低(P<0.05，P<0.01)，见表2。

2.2 肝脏组织病理学检测结果 正常组肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐；模型组肝脏脂肪变明显，肝小叶结构丧失，可见大量脂肪滴沉积，脂滴将细胞核挤向一侧；阿托伐他汀组脂滴较模型组少，可见部分肝小叶和肝细胞索；RLZD低剂量组脂滴比模型组稍少，有更多的小泡性脂肪变性；RLZD中剂量组脂滴较RLZD小剂量组少，但比对照组多，也有许多小泡性脂肪变性，可依稀分辨部分肝细胞索；RLZD高剂量组脂滴较少，有部分明显的肝细胞脂肪变性，可辨出部分肝细胞索和肝小叶。见图1。

2.3 各组大鼠肝脏AdipoR-2、PPARα表达比较 与正常组比较，模型组AdipoR-2、PPARα的表达显著降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，RLZD高、中、低剂量组AdipoR-2表达水平均较高(P<0.05，P<0.01)呈剂量依赖性升高。RLZD高剂量组PPARα显著高于模型组(P<0.01)。见表2。

表2 各组体重、肝重、肝脏指数、Lee指数、AdipoR-2、PPARα表达比较

与正常组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

图1 各组肝组织病理学检测结果(HE，×400)

3 讨 论

NAFLD病变主体在肝小叶，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性和脂肪蓄积为病理特征的临床病理综合征〔4〕。NAFLD与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关，常伴随肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征(MS)而发生，是MS的重要病理改变之一。本研究证实MS相关NAFLD模型复制成功。

PPARα主要表达在肝脏组织中，与脂质代谢和抑制炎性反应有关，在各自的表达组织中PPARα的靶基因参与了脂肪生成、代谢〔5〕、胰岛素敏感等多种生物学过程。研究表明，高脂喂养大鼠的PPARα mRNA表达含量降低，可引起一些与脂质代谢相关的蛋白质和酶基因转录水平降低，使脂肪酸的氧化能力减弱，从而引起脂质堆积〔6〕，肝细胞内脂质沉积则会使脂肪变性，加重胰岛素抵抗，促进非酒精性肝炎的发生〔7〕。脂联素由脂肪细胞分泌，能参与脂质的代谢调节。AdipoR-2主要表达在肝脏组织中〔8〕，在脂质代谢中，脂联素可能通过与AdipoR-2结合，从而激活PPARα途径〔9〕，或者活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)而发挥作用〔10〕。AMPK激活能增加脂肪酸氧化，抑制脂肪合成。通过这些途径使脂肪酸氧化加速及葡萄糖摄取增加，起到降低细胞内脂质含量和外周葡萄糖水平而改善胰岛素抵抗〔11〕。

RLZD是第三批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师黄祥武主任医师治疗MS、脂肪肝的经验方，有健脾祛湿、活血化瘀的作用。前期研究证实，本方能够降低MS模型大鼠血清抵抗素、升高脂联素，降低胰岛素水平及胰岛素抵抗指数〔12〕，降低血中三酰甘油、增加高密度脂蛋白水平〔3〕，发挥调节血脂代谢的作用。

本研究提示RLZD可能通过提高肝脏AdipoR-2和PPARα的表达来调节肝脏脂质代谢，发挥治疗NAFLD的作用。