骨髓间充质干细胞通过激活Wnt通路防治阿尔茨海默病

陈鹏 姚宏波

(齐齐哈尔医学院 1口腔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2基础医学院组胚教研室)

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性发展的中枢神经系统退行性疾病。临床表现为记忆能力的失活、失用，执行功能障碍，认知能力下降，同时多出现精神行为的异常，对中老年人身心健康产生严重危害。近年来，应用干细胞治疗AD逐渐被认可，其中骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种专能干细胞，来源于骨髓，具有自我更新和多向分化的能力，可以在特定的条件下转变成构成人体某种组织的细胞，BMSCs来源广泛，能为AD的治疗提供丰富资源，也为临床的自体细胞移植奠定了实验基础〔1〕。Wnt信号通路在神经系统的发生、发育及神经系统疾病的发生、发展等方面发挥重要作用，如轴突导向、突触形成、成年神经再生和神经细胞的保护和迁移等〔2〕。有研究显示，Wnt/β-catenin 信号的激活可以促进成体动物神经干细胞的增殖及向神经元分化〔3〕。本研究通过在AD大鼠海马区移植BMSCs，探讨在治疗AD的过程中是否存在Wnt通路的激活及对Wnt通路相关蛋白β-catenin及细胞周期蛋白(Cyclin)D1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 6～8月龄清洁级雄性Wistar大鼠，体重(200 ± 20)g，来自哈尔滨医科大学实验动物中心。兔抗β-catenin，Cyclin D1抗体一抗；羊抗兔 IgG；二氨基联苯胺(DAB)显色法检测试剂盒；β-淀粉样蛋白(Aβ)23～35；氢溴酸加兰他敏。

1.2 动物分组及处理 将40只大鼠随机分为5组，每组8只，正常组：常规鼠粮饲养，饮用水；模型组：称重后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪，切开皮肤暴露顶骨，按照大鼠脑立体定位仪图谱在双侧海马区注射10 μl Aβ23～35，缓慢注射5 min注完，注射结束需继续留针5 min，将骨孔用牙托粉封固，皮肤缝合，前3 d，每日肌注10万U青霉素。常规饲养7 d后，用Moriss水迷宫检测造模是否成功，成功后不进行任何治疗；模型对照组：注射生理盐水代替Aβ23～35，方法同模型组；移植组：建立AD大鼠模型2 w后，对AD模型大鼠进行BMSCs移植，注射部位为原Aβ23～35的注射部位，术后处理同模型组；西药组：建立AD大鼠模型后，氢溴酸加兰他敏灌胃治疗，每日每千克体重0.6 mg，治疗30 d〔4〕。

1.3 BMSCs的培养、鉴定及移植 原代培养，将大鼠麻醉后在无菌条件下取双侧股骨，将两侧干骺端剪断，注射器将骨髓冲出，淋巴细胞分离离心，去上清，取云雾状细胞，接种于75 cm2培养瓶中，密度5×105/cm2，培养体系为DMEM培养基、10%胎牛血清、青/链双抗，隔日在倒置显微镜下观察细胞形态。当细胞约80%汇合时，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)进行消化，然后终止消化用含胎牛血清的培养液，制成单细胞悬液后进行传代，细胞扩增好后对其进行CD44免疫组化染色鉴定。检测造模成功后，行BMSCs移植，注射部位为原Aβ23～35的注射部位，将BMSCs悬液注入AD模型大鼠双侧海马区，每侧10 μl缓慢注射，1 μl/min，留针约5 min。染色后BMSCs阳性为胞核蓝色，胞质褐色。

1.4 行为学实验 Morris水迷宫的组成：一个不锈钢圆形水池和一个可以移动的平台。水池上方有摄像机和监视器与计算机相连，跟踪记录大鼠游泳轨迹和游泳时间。水池被等分为平台象限、对侧象限、右侧象限和左侧象限4个象限，并用不同形状进行标记。在平台象限正中放置平台，将大鼠头部染成黑色，将大鼠面向池壁，在其他3个象限中任一点放入水中。记录大鼠逃避潜伏期，即每次自入水至爬上平台的时间。方法如下：将大鼠编号，第1天让大鼠适应环境，自由游泳2次，每次120 s；第2天起，每天上、下午各进行水迷宫训练1次，连续3 d，共计6次，训练时间同上，120 s未找到平台则以120 s计算，为了加强记忆，每次训练后，将大鼠引导至平台上15 s。记录大鼠平均逃避潜伏期。

1.5 形态学实验 取脑组织海马进行石蜡切片制作并采用苏木素-伊红(HE)染色观察海马神经元的形态及超微结构的改变。HE染色步骤：①石蜡切片二甲苯脱蜡；②梯度乙醇脱水至蒸馏水水洗；③苏木精染色；④自来水稍冲洗；⑤1%盐酸乙醇分化、水洗；⑥伊红复染；⑦酒精脱水；⑧二甲苯透明、自然干燥；⑨封片。光学显微镜下观察并拍照。

1.6 免疫组化染色 采用PV二步法进行免疫组化检测各组AD大鼠海马Wnt信号通路β-catenin及Cyclin D1蛋白的表达，对照组一抗用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，光学显微镜下观察。

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行方差分析；图像处理应用ImageJ。

2 结 果

2.1 BMSCs的培养、鉴定及移植 BMSCs呈细长纤维状，贴壁生长后变成长梭形，分布呈漩涡样，折光性好，形态饱满。染色后可见BMSCs表达阳性，阳性细胞比例在99%以上。

2.2 行为学检测 模型组与正常组、模型对照组比较，逃避潜伏期及游泳路程明显增长(P<0.01)；移植组和西药组明显低于模型组(P<0.05)。见表1。

2.3 形态学变化 正常组和模型对照组海马区锥体细胞和颗粒细胞胞质丰富，排列规则且整齐紧密，层数较多。模型组锥体细胞和颗粒细胞可见被破坏现象，胞质浓缩染色较深，核固缩，细胞排列稀疏且紊乱，细胞体积缩小，间隙扩大。移植组和西药组颗粒细胞核圆，但细胞数量较正常组减少，细胞排列较规整，界限较清晰。见图1。

表1 各组平均逃避潜伏期及游泳路程比较

与模型组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；下表同

图1 各组海马HE染色(×400)

2.4 免疫组化检测结果 正常组和模型对照组β-catenin蛋白在大鼠海马神经元的胞质内阳性表达；模型组阳性表达细胞数明显减少(P<0.01)；移植组和西药组明显多于模型组(P<0.05)。正常组、模型对照组Cyclin D1蛋白在细胞核内表达；模型组阳性表达明显降低(P<0.01)；移植组和西药组明显多于模型组(P<0.05)，见表2。

表2 各组海马蛋白β-catenin 及Cyclin D1表达阳性细胞数个/mm2,n=8)

3 讨 论

AD病因目前尚不明确。根据2010年失智症报告显示，全球AD患者约有3 560万例，且增长速度约每20年翻1倍，估计到2030年AD患者将达约6 500万例，且发展中国家居多〔5〕。AD主要有三大病理改变：Aβ形成、tau蛋白的过度磷酸化及神经炎症，其产生的神经毒性最终导致大量海马神经元凋亡。

BMSCs具有多向分化的潜能，应用不同的诱导剂可分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞及神经元等〔6〕，故近些年BMSCs被作为移植治疗多种疾病的种子细胞〔7〕。在体内外实验中，BMSCs在适当的条件下可诱导分化为神经元，但调控机制目前尚不清楚。据报道，BMSCs在定向分化过程中，Wnt信号通路具有一定的调控作用〔8〕。Wnt/β-catenin信号通路是最经典的Wnt通路，Wnt 3a蛋白与细胞膜上的相应受体结合，Wnt信号通路被激活，使未被磷酸化的β-catenin从细胞质进入细胞核，并启动相应靶基因的转录，从而产生多种细胞效应〔9〕。其中激活Wnt 信号通路后，可启动靶基因Cyclin D1 的转录〔10〕。Beaulieu等〔11〕发现，在Wnt /β-catenin 通路激活剂或Wnt 配体作用下，可增强 β-catenin蛋白的表达及该通路下游靶基因中存活基因如 Cyclin D1的表达，减弱 Aβ 的神经毒性，对神经元起保护作用。有研究还发现Cyclin D1的调控机制有利于Cyclin D1在 AD 病理发展中作用的研究〔12〕。

目前有报道证实，通过Wnt信号通路的激活可使AD大鼠脑组织内的炎症得到改善〔13〕。BMSCs在向神经元分化时，胞质内游离β-catenin蛋白的表达明显增加；而Wnt信号通路受到抑制时，BMSCs的分化明显减少〔14〕。所以推断Wnt 信号通路对AD的发生有严重影响，但目前许多机制仍不明确，还有待继续研究〔15〕。本研究显示，BMSCs移植可以缩短AD模型大鼠的逃避潜伏期和游泳路程，对学习记忆能力起到改善作用；模型组胞质内游离的 β-catenin 减少，抑制了Wnt信号通路的转导，从而使靶基因 Cyclin D1 的表达有所下调。经过BMSCs移植后，胞质内游离β-catenin表达增多，激活了Wnt信号通路，使Cyclin D1 的表达增强，并且能够促进神经元之间突触的发生。因此，BMSCs移植治疗AD的机制可能是通过激活Wnt/β-catenin通路，调控细胞周期，从而起到保护神经元的作用。

BMSCs具有高分化潜能，可以实现自体移植，具有低免疫原性，避免了移植后的排斥反应。同时，BMSCs易于获取，故不涉及医学伦理问题，作为组织工程的种子细胞，具有十分广阔的应用前景〔16〕。