黑果枸杞中总黄酮的降脂活性研究

艾克山·吾拉木， 谭扬扬， 古丽巴哈尔·卡吾力

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)又名黑枸杞，是茄科植物枸杞属的一种球形浆果。多为棘刺灌木，分枝多、白色，皮薄，熟后成紫黑色。主要种植于中国的新疆、青海、宁夏、甘肃等西北地区。黑果枸杞含有多种维生素、矿物质、原花青和糖类素等丰富的营养成分。藏医称其名为“旁玛”，被认为其性平、味甘、清心热，主要用于心脏病、月经异常、心热病等疾病的治疗中。《中药志》中载有将黑枸杞根皮和果实用于医治齿龈出血、尿道结石和癣疥等疾病中，具有润肺止咳、清肺降火、补肾益精和养肝明目等功效[1]。现代医学研究表明，黑枸杞中的黄酮类成分还具有降低总胆固醇、抗炎、降血糖等作用。

黄酮类化合物是一类结构复杂、种类繁多，广泛存在于植物体内的花、叶、根茎以及其果实中的植物次生代谢产物。化学结构以C6-C3-C6为基本骨架，根据三碳键的氧化程度以及B环连接位置的不同主要分为异黄酮、查耳酮、二氢黄酮等不同种类[2]。多项科研成果表明,黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等免疫活性以及抗心血管疾病、降血压、抗病毒、镇痛等药理作用[3]。

高脂血症(Hyperlipidemia，HLP)主要是指血浆中的甘油三酯、胆固醇等一种或者多种脂质成分出现异常(即异常增高)而出现的机体代谢紊乱性综合疾病。高脂血症患者经常出现头晕、胸闷以及失眠等一系列症状，若医治不及时，则会引发为心肌梗死、动脉粥样硬化、高血压、冠心病，甚至会出现脑卒中等严重后果[4]。目前临床上用于治疗高脂血症的西药种类繁多，见效显著，但是不良反应也屡见不鲜。本研究通过建造SD大鼠高脂血症模型来探讨中药提取物黑果枸杞总黄酮对实验性高脂血症SD大鼠的降血脂作用来验证方案的可行性。

1 仪器与试药

1.1 仪器KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HWS-24型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)，德国梅特勒ABJ220-4NM型电子分析天平(规格为0.005～0.1 mg，上海岛韩实业有限公司)，EYELAN-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，组织匀浆器(上海求精玻璃仪器厂)，德国Sigma S-18K型离心机(北京鑫盛鸿阳科技有限公司)，Thermo Scientific Multiskan GO全波长酶标仪(北京金业德祥生物科技有限公司)。

1.2 耗材灌胃器材，手术器械(1套)，一次性普通真空采血管和采血针， 96孔细胞培养板，2.0 mL冻存管(圆底可立，外旋盖)，5.0 mL离心管，1.5 mL微量离心管(带锁扣，透明尖底)，YYQ-100P移液枪。

1.3 试药辛伐他丁片(杭州默沙东制药有限公司，批号：20180423)，总胆固醇(TC)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20180526)，甘油三酯(TG)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20180526)，低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20180526)，高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20180526)，无水乙醇(天津市大茂化学式机厂，批号20170701)，石油醚(天津市富宇精细化工有限公司，批号：20160716)，胆固醇(上海蓝季有限公司，批号180110)，胆酸钠(上海蓝季有限公司，批号：180305)，丙基硫氧嘧啶(上海蓝季有限公司，批号：180317)，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160125)，复方氯化钠注射液(国药集团新疆制药有限公司，生产批号：1810003)，普通级别大鼠维持饲料(新疆医科大学实验动物中心提供)。

1.4 实验动物雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，SPF级饲养环境，批号：20180321，合格证号：SCXK(新)2015-0003，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.5 药材黑果枸杞(采自新疆阿克苏地区塔里木盆地)，经新疆医科大学药学院生药教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)的果实。

2 方法

2.1 黑果枸杞总黄酮的提取本研究是黑果枸杞系列研究的一部分。该研究中总黄酮的提取方法参考了以往研究中已确立的提取工艺方法[5-6]。方法为将黑果枸杞研磨成粉末状包裹在滤纸里放入索氏提取器中，在90℃、150 mL石油醚中进行脱脂2 h得到经脱脂的黑果枸杞粉末物。将经脱脂过的黑果枸杞粉末物，设定超声功率为70 W、温度为60℃，用体积分数为70% 乙醇为溶剂，料液比为1∶5 g/mL的条件下超声提取45 min，然后旋转蒸发浓缩滤液、冷冻干燥得粗提物(含量达到4.0%)，备用。

2.2 高脂饲料的制备高脂饲料由按成分比为65%大鼠普通维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+1%胆酸钠+0.5%丙基硫氧嘧啶+1%混合调和剂(鸡蛋黄+花生)组成。

2.3 高脂模型的建立SD大鼠先在饲养温度(24±2)℃，湿度(50±10)%，明暗周期12 h的环境下自由饮水，并给予普通饲料饲养1周后，按照体质量随机分配2组，其中15只大鼠继续给予大鼠普通维持饲料空白对照组，其余75只大鼠给予高脂饲料建立高脂血症模型组。每周称量体重1次，造模3周后，每组取若干大鼠断尾采血(期间大鼠不禁食)，血浆凝固后，放入离心机3 500 转/min离心10 min，分离血清，取出上清液，测定大鼠血清中甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的浓度。

2.4 动物分组与给药剂量的确定选取造模成功的SD大鼠60只，随机分为6组(每组10只)，分别为正常对照组(NC组)、高脂血症模型组(MC组)、辛伐他汀组(3.3 mg/kg，S组)以及黑果枸杞总黄酮粗提物高剂量组(100 mg/kg，HF组)、中剂量组(50 mg/kg，MF组)和低剂量组(25 mg/kg，LF组)。辛伐他汀片剂对高脂血症患者的最大剂量推荐量为30 mg，根据SD大鼠和人体表面积的换算方法，将高脂血症大鼠的给药剂量换算成3.3 mg/kg。黑果枸杞总黄酮粗提物高、中、低剂量组给药剂量通过查阅文献[7-8]的方法，最终确立为分别为100、50、25 mg/kg。

正常对照组SD大鼠喂养基础饲料，其他组喂养高级脂肪饲料，14 d后开始给药。其中正常对照组和高脂血症模型组每天灌胃生理盐水，灌胃体积为10 mL/kg BW(body weight)[9]。黑果枸杞总黄酮粗提物设置低剂量组、中剂量和高剂量组，并持续给药4周，期间大鼠自由饮食进水，每周固定时间记录大鼠的体质量。

2.5 动物的处理和测定指标

2.5.1 实验动物的处理 最后一次给药后，禁食不禁水24 h，称重，并把大鼠用10%的水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉[10]。之后使之仰卧固定在手术布上剪开腹腔，分离出静脉血管，并迅速插针采取5 mL的全血于真空采血管中备用。最后通过颈部脱臼的方法处死SD大鼠并取出其肝脏，浸置于4℃生理盐水中去残血并用滤纸吸干，称重，制备肝组织匀浆液。

2.5.2 血清与肝组织液中各项指标的测定 使用全波长酶标仪分别用TC、TG、HDL-C和LDL-C试剂盒测量SD大鼠血清和肝组织匀浆液中相应指标的水平。

肝脏指数=肝脏质量/大鼠体质量×100%

3 实验结果

3.1 实验动物体质量变化分析实验后各组SD大鼠的体质量均呈现增高趋势。但是正常对照组、模型组和黑果枸杞总黄酮粗提物低剂量组SD大鼠的体质量增重率较为显著，与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，说明黑果枸杞总黄酮粗提物低剂量组对抑制高脂血症SD大鼠体质量的增长效果并不明显。辛伐他汀组、黑果枸杞总黄酮粗提物高剂量组、中剂量组与其余组相比，对高脂血症SD大鼠体质量的增长率有抑制作用，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明高剂量与中剂量的黑果枸杞总黄酮粗提物同辛伐他丁都具有减缓高脂饲料对高脂血症SD大鼠体质量增长的效果，结果见表1。

表1 6组SD大鼠体质量变化

注：与正常对照组实验前体质量对比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 6组SD大鼠肝指数的比较实验过程中模型组SD大鼠较正常对照组SD大鼠体重增长迅速，且不喜欢运动，毛发暗淡，脱毛比较多。实验结束时正常对照组SD大鼠肝指数比高脂血症模型组SD大鼠肝指数明显降低(P<0.01)，其中黑果枸杞总黄酮粗提物中、高剂量组、辛伐他汀组SD大鼠肝指数与高脂血症模型组SD大鼠肝指数比较，显著降低(P<0.05)。结果见表2。

3.3 6组SD大鼠血清中各指标浓度的比较根据标准曲线计算得出血清中各指标，由表3可知，与正常对照组SD大鼠相比，黑果枸杞总黄酮粗提物高、中剂量组SD大鼠血清中TG、TC、LDL-C浓度无明显差异；辛伐他汀组、黑果枸杞总黄酮粗提物各剂量组与高脂血症模型组相比，HDL-C浓度明显升高(P<0.01)，而TG、TC、LDL-C浓度呈降低趋势(P<0.05)。表明黑果枸杞总黄酮具有调节血脂代谢的功效，且与剂量呈正相关，见表3。

3.4 6组SD大鼠肝组织液中各指标浓度的比较根据标准曲线计算得出肝组织液中各指标，由表4可知，与正常对照组SD大鼠相比，黑果枸杞总黄酮粗提物高、中、低剂量组SD大鼠肝组织液中TG、TC、LDL-C浓度升高(P<0.05)，HDL-C浓度无明显差异；辛伐他汀组、黑果枸杞总黄酮粗提物各剂量组与高脂血症模型组相比，肝组织中HDL-C浓度明显升高(P<0.05)，而肝组织中黑果枸杞总黄酮粗提物高、中剂量组TG、TC、LDL-C浓度与高脂血症模型组相比，呈降低趋势(P<0.01)。表明黑果枸杞总黄酮具有调节肝脏中脂质代谢的作用，此作用与其剂量呈正相关,见表4。

表2 6组SD大鼠肝指数的比较

注： 与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

表3 6组SD大鼠血清中各项指标浓度比较(mmol/L， ±s)

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01； 与高脂血症模型组相比，&P<0.05，&&P<0.01。

表4 6组SD大鼠肝组织液中各项指标浓度比较(mmol/L， ±s)

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01； 与高脂血症模型组相比，&P<0.05，&&P<0.01。

4 讨论

高脂血症往往会使机体脂质代谢紊乱，导致血清或肝组织中的HDL-C水平降低或者LDL-C、TG、TC等水平增高。本实验结果显示，黑果枸杞总黄酮粗提物中、高剂量组和辛伐他汀组相同，都具有减缓高级脂肪饲料对SD大鼠体重增长的效果，且与正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。从SD大鼠肝指数的影响水平看，黑果枸杞总黄酮粗提物中、高剂量组、辛伐他汀组与高脂模型组比较，肝指数显著降低(P<0.05)。从血清和肝脏中有关脂蛋白浓度的变化情况可以看出，与高脂血症模型组相比，黑果枸杞总黄酮粗提物中、高剂量组同辛伐他汀组大鼠血清和肝组织中HDL-C浓度升高且差异具有统计学意义(P<0.05)，TG、TC、LDL-C浓度降低且差异具有统计学意义(P<0.01)，可以进一步说明黑果枸杞总黄酮具有调血脂作用，并与其剂量呈正相关。

黄酮类化合物可能对脂质的吸收和合成产生影响。Kobayashi等[11]研究表明，红茶黄酮通过抑制胰脂肪酶的活性来减少血液中甘油三酯的重吸收；柿子黄酮则可以调节胆固醇7α强化酶基因和胆固醇调节原件结合蛋白(SREBP)基因的表达来对脂蛋白受体产生影响[12]。同时，黄酮类化合物通过抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)和胆固醇酰基转移酶(ACAT)的活性来降低胆固醇的形成。

Ji等[13]研究表明，黄酮类化合物对肝脏中ABC转运蛋白A1[(ABC)A1]进行协同性增加来使载脂蛋白A提高高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的作用效果。Guo等[14]则研究认为黄酮通过激活肝X受体基因(LXR)和核转录因子过氧化物酶增殖体激活受体基因(PPARs)来激活肝脏中ABC转运蛋白A1[(ABC)A1]启动子，使载脂蛋白A-1(apoA-1)和载脂蛋白A-2(apoA-2)产生作用来抑制载脂蛋白C-3(apoC-3)的表达。黄酮类化合物的这些降脂作用可以认为是通过促进脂质代谢作用来实现的，黑果枸杞总黄酮降脂活性的作用机制尚待进一步的研究。