丁苯酞对老年兔心搏骤停复苏后的影响

杨虹 成静 陈芳 高贻钧 卢军 王凌

(1武汉市第四医院 华中科技大学同济医学院附属普爱医院急诊科，湖北 武汉 430034；2华中农业大学)

心搏骤停(CA)是世界范围内主要急诊死亡原因之一，每年有超过45万人发生CA〔1〕。随着心肺复苏(CPR)术逐步得到推广和普及，患者经复苏后自主循环恢复(ROSC)得到提高，但存活率依然很低〔2〕。CA后ROSC主要的病理生理变化是缺血再灌注损伤，造成全身炎症反应及凝血功能障碍，进一步形成多器官损伤〔3～5〕，特别是脑损伤。丁苯酞(NBP)有抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡、抑制心肌细胞肥大、对心脏内皮细胞保护等广泛药理作用〔6〕，对急性脑缺血具有明显的治疗作用〔7，8〕，并已证明在一定程度上可减轻多器官损伤〔9〕。本研究欲探讨NBP对老年兔CA复苏后多器官的保护作用。

1 材料与仪器

1.1实验动物 选用30月龄体重为3.0～3.5 kg的清洁级健康家兔48只，性别不限，购于湖北逸挚诚生物科技有限公司，实验动物使用许可证SYXK(鄂)2016-0088。动物置于(25±1)℃，相对湿度为(50±10)%，白天黑夜各12 h的清洁级环境中适应性喂养1 w，自由进食、饮水。

1.2主要试剂与实验仪器 NBP(石药集团恩必普药业有限公司，国药准字H20100041，规格100 ml∶25 mg)，肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S-100B酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D公司)，DXC-800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，致颤仪及动物胸外按压设备(由华中农业大学辅助研发，动物胸外按压设备申请专利号：201820076129.4)，SAR-830A小动物呼吸机(美国CWE公司)，mindray BeneHeartD3除颤仪监护仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，一次性气管插管导管及配套导丝(河南驼人医疗器械集团有限公司)。

1.3动物准备 所有实验动物耳缘静脉穿刺置入24G Y型静脉留置针，置管成功后注射3%戊巴比妥30 mg/kg予以麻醉。麻醉成功后将动物固定后行胸腹部备皮，连接三通开关，一端连接含有肝素(5 IU/ml)抗凝的生理盐水输液器，防止血液凝固，另一端经换能器与心电监护仪相连。将2.5号气管插管导管自兔口角缓慢置入，导管远端到门齿的距离为11～12 cm。手术操作完成并稳定后，记录肛温(T)、心率(HR)、呼吸频率(RR)、平均动脉压(MAP)、等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(dp/dtmax)、等容舒张期左心室内压力下降的最大速率(-dp/dtmax)。

1.4动物模型建立 将欲建模动物置入2个电极，一个置入皮下(位于心搏最强点)，另一个置于食管内，应用致颤仪持续交流电(10 V，4 mA，2 min)经食管致颤。致颤成功的判断标准：①电刺激后动脉收缩压逐渐下降至25 mmHg以下；②血压监测的动脉搏动波形消失；③停止电刺激后心电监护示心电图波形为室颤。致颤成功后无处理心室颤动6 min后，开始应用动物胸外按压设备进行机械胸外按压，按压部位为胸骨体正中，频率为200次/min，按压深度为胸廓前后径的1/3，按压/放松比为1/1，并同步机械通气，尽早给予双向波经胸体外除颤。机械通气接小型动物呼吸机。呼吸机初始参数设定频率为45次/min，潮气量10 ml/kg。开始CPR的即刻耳缘静脉注射肾上腺素0.15 mg/kg，必要时每间隔3 min重复应用。待除颤仪准备完全后若为室颤，则予非同步双相波10 J除颤，若不能转复为自主心律则再继续按压2 min后再次予10 J除颤，直至ROSC。当恢复窦性HR及MAP>40 mmHg并至少持续1 min以上视为复苏成功。动物经上述程序抢救30 min自主循环未能恢复者为复苏失败，对复苏失败者移除所在组别。对ROSC的动物进行心电和血流动力学监测，自主呼吸微弱者进行机械通气，自主呼吸恢复后拔除所有导管，放回笼中饲养，对于不能自主饮水、进食的动物，在ROSC后每12 h经耳缘静脉缓慢补充5%葡萄糖氯化钠溶液20 ml/kg，观察终点为72 h。

1.5实验分组 实验分为①CA复苏(CA)组(n=24)，将动物麻醉后，行气管插管，心电监护，有创血压监测，并致颤及CPR建模，建模及复苏成功后观察至72 h；②NBP干预(NBP)组(n=24)，将动物麻醉后，行气管插管，心电监护，有创血压监测，并致颤及CPR建模成功后立即耳缘静脉注射NBP 5 ml/d。建模及复苏成功并注射药物后观察至72 h。

1.6标本的采集检测和神经功能学评分 CA组及NBP组完成预设处理后，分别于CA前、ROSC后12 h、24 h、72 h采血和进行神经功能评分。血清NSE、S-100B的水平按ELISA试剂盒说明进行检测。血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTn)I的水平用全自动生化分析仪检测。神经功能评分由2名非本实验组成员，参照Jia等〔9〕神经功能学评分(NDS)方法，从意识、基本反射、运动、行为等方面对存活兔在ROSC后各时间点进行神经功能评定，总分0～80分，评分越低，代表脑神经功能越差。0分为脑死亡，80分为正常。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0进行重复测量方差分析。

2 结 果

2.1两组基础参数和诱导室颤情况 在诱导室颤前，两组兔的体重、HR、血流动力学参数比较差异无统计学意义(均P>0.05)。 见表1。

本实验中的48只家兔全部诱发室颤成功。在电刺激开始后，动脉血压迅速下降到25 mmHg以下，搏动波形消失。电刺激结束时室颤发生率为100%(48/48)，无无脉性电活动及CA发生。4例室颤转为无脉性电活动，在CPR开始时心电图表现为室颤的比例为87.5%(42/48)，无脉性电活动比例为12.5%(6/48)。

2.2两组脑损伤指标变化及NDS评分比较 CA组ROSC后12 h、24 h、72 h血清NSE、S-100B的水平显著高于CA前，NDS评分显著低于CA前(P<0.05)。NBP组ROSC后12 h、24 h、72 h NSE、S-100B均比CA组同时间点明显降低,NDS评分比CA组同时间点明显升高(P<0.05)。见表2。

2.3两组器官损伤指标变化比较 CA组ROSC后12 h、24 h、72 h血清Cr、BUN、ALT、AST、cTnI的水平显著高于CA前，差异有统计学意义(P<0.05)。CA组ROSC后12 h、24 h血清CK-MB的水平显著高于CA前，差异有统计学意义(P<0.05)，而ROSC后72 h血清CK-MB的水平与CA前比较差异无统计学意义(P>0.05)。NBP组ROSC后12 h、24 h、72 h血清Cr、BUN、ALT、AST的水平均显著低于同时间点CA组，差异有统计学意义(P<0.05)。NBP组ROSC后12 h、24 h血清CK-MB、cTnI水平比同时间点CA组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而NBP组ROSC后72 h血清CK-MB、cTnI水平与同时间点CA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别体重(kg)体温(℃)HR(次/min)MAP(mmHg)RR(次/min)dp/dtmax-dp/dtmaxCA组2.17±0.7238.53±0.35238±1090±937±45 156±712-3 373±378NBP组2.07±0.6838.24±0.32235±1192±738±65 097±702-3 385±348

指标组别CA前ROSC后12 hROSC后24 hROSC后72 hNSE(pg/ml)CA组7.28±0.9522.01±2.211)32.33±1.941)19.67±1.881)NBP组8.35±1.1018.65±0.982)21.68±1.522)14.02±1.622)S-100B(pg/ml)CA 组7.23±2.0217.11±3.681)12.66±2.431)8.24±1.861)NBP组8.66±1.9212.03±1.692)8.63±2.132)7.18±1.622)NDS(分)CA组80.0±0.053.8±3.91)56.8±3.81)68.2±2.51)NBP组80.0±0.065.6±3.52)68.5±4.02)75.3±2.22)

与CA前比较：1)P<0.05；与同时间点CA组比较：2)P<0.05；下表同

不同时间点组别Cr(μmol/L)BUN(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)CK-MB(U/L)cTnI(μg/L)CA前CA组53.17±4.726.74±1.9343.23±4.2637.92±2.06486.43±39.814.75±0.82NBP组54.68±5.126.57±1.7644.32±4.4739.25±2.54493.68±55.844.54±0.75ROSC 12 h CA组117.28±6.231)13.53±2.821)68.14±5.651)55.64±3.421)722.35±203.121)27.34±2.681)NBP组85.74±3.432)8.67±2.142)51.42±4.152)43.16±3.622)556.63±54.182)13.02±2.472)ROSC 24 h CA组133.42±3.321)22.34±1.691)92.74±4.211)75.43±4.011)2 353.67±443.671)42.05±3.291)NBP组112.39±2.962)14.95±0.992)72.01±3.932)56.46±4.362)1 569.47±113.662)31.05±3.652)ROSC 72 h CA组156.08±4.121)28.65±3.181)186.24±3.651)152.20±3.851)519.88±57.1516.65±2.131)NBP组133.28±4.352)20.45±1.962)150.16±5.552)120.13±3.482)505.50±59.2410.08±1.80

3 讨 论

NBP是人工合成的左旋芹菜甲素的消旋体，是临床用于急性缺血性脑卒中的常用药物〔7,8〕。心脏骤停4～6 min后便可发生神经元不可逆的损伤〔10〕，Zhang等〔11〕研究发现用NBP治疗大鼠心搏骤停时能有效提高海马CA1区神经元的存活率，它的潜在治疗机制包括内皮细胞免受氧化应激、线粒体损伤和随后的细胞死亡、增加血管内皮细胞生长因子和缺氧诱导因子(HIF)-1α的表达、改善脑微血管、抑制炎症反应、维持神经元的结构和形态，促进神经功能恢复〔7，8〕，本研究通过比较CA组和NBP组两组兔在心搏骤停后不同时间点的NDS评分，也支持上述观点。NSE和S100B是多种疾病脑损伤的指标，可用于准确地评估CPR后患者的脑损伤严重程度〔12～14〕。本实验中CA组血清中NSE、S-100B的水平显著增高，NSE于复苏后24 h达高峰，而S-100B于复苏后12 h达高峰。而在NBP组中，复苏后各时间点上述指标水平显著低于CA组，提示NBP对兔心搏骤停后的脑损伤有治疗作用。

缺血/再灌注损伤广泛存在于心搏骤停自主循环恢复后心、脑、肝、肾、胃肠道等器官，发病过程涉及多个凋亡相关基因〔15，16〕。NBP对凋亡途径中关键的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3 蛋白发挥抑制作用，同时NBP还可能通过降低花生四烯酸含量，提高脑血管内皮 PGI2 的水平，抑制谷氨酸释放，降低细胞内钙浓度，抑制自由基和提高抗氧化酶活性，进而阻断多个缺血/再灌注病理环节，进而达到保护细胞的目的。Wang等〔17〕研究结果表明兔经心搏骤停复苏后，血清Cr、ALT水平随复苏后时间的推移逐步升高，复苏后72 h达顶峰，与本实验中Cr、ALT增长趋势一致。本研究结果显示，兔心搏骤停复苏后血清Cr、BUN、ALT、AST的水平随复苏后时间的推移逐步升高，在本研究设置的观察点中，复苏后72 h的水平最高。但并不能因此认为复苏后72 h是顶峰值，可能在72 h之后的时间里出现顶峰值，而在本研究中因时间点的有限并不能观察到。本研究中，兔心搏骤停经复苏后血清CK-MB水平于24 h达高峰，72 h与CA前无统计学差异，cTnI水平于24 h达峰值，72 h仍未恢复正常，此两者变化趋势与人体无异。NBP干预组，血清Cr、BUN、ALT、AST水平在复苏后12 h、24 h、72 h较之CA组显著降低，血清CK-MB、cTnI水平在复苏后12 h、24 h较CA组显著降低，与Wang 等〔17〕报道大鼠心肌梗死模型NBP 改善心脏血流动力学功能和减少心脏梗死面积的结果较为一致。因此，推断NBP能够改善心搏骤停复苏后家兔肝肾心的损伤。

本研究受到NBP治疗脑梗死取得良好效果的启发，在兔心搏骤停复苏模型的基础上，应用NBP对其进行干预，结果显示，预防应用NBP对复苏后脑、心、肝、肾等多器官损伤具有一定保护作用，可能是一种潜在的治疗心搏骤停和复苏的策略。其可能的机制包括提高缺血区血流量; 抗氧化减少细胞凋亡; 改善线粒体肿胀和空泡化〔18〕。虽然本研究的思路是创新性的，但仅抽取血液指标和NDS评分来评估NBP对心搏骤停复苏后家兔的影响，其行为功能、器官组织形态是否有所改善，需进一步研究。