透骨香醇提液抗类风湿关节炎的作用及机制

姚文琴 余跃生 王定瑜 党荣敏 郑文 宋伟

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558003)

类风湿关节炎(RA)是严重影响人类健康的难治病，以累及周围关节为主的多系统炎症性的自身免疫性疾病，其特征症状为对称性、周围性多个关节慢性炎性病变，临床表现为受累关节疼痛、肿胀、功能下降，病变呈持续、反复发作过程。透骨香是杜鹃花科植物滇白珠Gaultherialeu-cocarpaBl.var.crenulata ( Kurz ) T.Z.Hsu 的茎叶，性热，味辛、辣，属热药，入冷经，其根、梗具活血祛瘀、祛风除湿作用，可治风寒湿痹，筋骨疼痛〔1〕等。化学成分主要有挥发油、香豆精类、有机酸、黄酮、木脂素苷类，具有镇痛、抗炎、抗病毒作用，多用于风湿性关节炎、跌打损伤和湿疹等方面的治疗〔2〕，临床常见含透骨香的复方成药有“滇白珠糖浆”“复方伸筋胶囊”“痛风灵”等，为苗族民间治疗类风湿病的习用药材，疗效突出〔3〕。本研究旨在探讨透骨香醇提液对类风湿关节炎的治疗作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与药物 SD雄性大鼠(SPF级)60只，体重250～270 g，由第三军医大学实验动物中心提供。透骨香购自贵州省黔南州都匀市药材市场，经黔南民族医专药学系鉴定为杜鹃花植物滇白珠 Gaultherialeu-cocarpa Bl.var.crenulata ( Kurz ) 。药物提取采用醇提法，分别取一定体积配制成浓度(相当于原药材)为4，2，1 g/ml储备液备用。雷公藤多苷片(湖南千金协力药业有限公司，规格：10 mg/片，批号(20170501)，人日用量为1.0～1.5 mg/(kg·d)，按人60 kg体重折算为大鼠等效剂量。

1.1.2试剂与仪器 卡介苗(批号201309a017-1)，上海生物制品研究所；CII(批号：112D055)为sigma公司产品；大鼠白细胞介素(IL)-17、血管内皮生长因子(VEGF)、IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒〔酶联免疫吸附试验(ELISA)〕北京索莱宝科技有限公司提供，批号：201406；酶标仪(mindrady MR-96A)。

1.2方法

1.2.1Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型的建立 根据大鼠关节红肿程度、范围及关节肿大变形情况，采用五级评分法进行关节炎指数评分，观察关节肿胀受累情况。造模及评分标准参照文献〔4，5〕。

1.2.2动物分组与实验干预 将60只SD大鼠随机分为6组，每组10只。分别为正常对照组、模型对照组、雷公藤多苷组、透骨香高、中、低剂量组。正常对照组和模型对照组均给予等量蒸馏水灌胃；透骨香治疗组分别给予4、2、1 g/kg透骨香醇提物灌胃；雷公藤多苷组给予雷公藤多苷溶液6 mg/(kg·d)灌胃。以上各组给药体积为20 ml/kg，连续给药 21 d。

1.3指标检测

1.3.1脏器指数 末次给药2 h后称重处死大鼠，取出肝、脾及肾脏等脏器，用电子天平称质量，计算脏器指数。脏器指数=脏器湿质量/体重× 100%。

1.3.2血清 IL-17、VEGF、IL-1β、TNF-α水平检测 各组大鼠连续灌胃21 d，禁食24 h，于第21天灌胃2 h后股动脉取血2 000 r/min离心15 min取上清液，-20℃下保存待测。IL-17、VGEF、IL-1β和TNF-α采用ELISA法按试剂盒说明书操作。

1.3.3病理检查 剪取踝关节，去掉皮肤组织，迅速置10%甲醛固定脱钙液中，取固定好的踝关节先后用70%、 80%和90%乙醇脱水，再依次将组织块进行透明处理后放入已溶的石蜡内浸蜡包埋、切片，放入温箱内干燥待染，将烘干好的石蜡切片进行脱蜡(3缸二甲苯)水洗后进行苏木素-伊红染色(HE)，中性塑胶封片镜检。

1.4统计学分析 采用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组脏器指数比较 与模型对照组比较，雷公藤多苷组肝脏脂数明显降低(P<0.01)，透骨香中剂量组肝脏指数明显升高(P<0.01)，见表1。

表1 各组体重及脏器指数比较

与模型对照组比较：1)P<0.01

2.2各组血清 IL-17、VEGF、IL-1β、TNF-α水平比较 与模型对照组比较,不同剂量透骨香治疗组可显著降低血清中IL-17、IL-1β、TNF-α水平，差异有统计学意义(P<0.01)，并呈现剂量依赖；对VGEF的影响则以中、高剂量组为主。见表2。

2.3病理检查结果 正常对照组：关节周围组织结构正常，滑膜细胞、软骨及骨组织中未见炎症性病变。模型对照组：滑膜上皮增生，部分上皮坏死脱落，上皮下及纤维脂肪中可见大量中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、单核细胞弥漫浸润，并见脂肪坏死、肉芽肿形成。雷公藤多苷组：滑膜上皮增生，滑膜细胞及周围纤维脂肪组织中淋巴细胞、浆细胞、单核细胞明显减少，肉芽肿数量也明显减少，仍可见少量中性粒细胞。透骨香低剂量组：镜下病变同模型对照组。透骨香中剂量组：滑膜组织及周围纤维脂肪仍可见中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、单核细胞弥漫浸润，肉芽肿形成。与低剂量组比较，以上炎症细胞及肉芽肿病变略为减少。透骨香高剂量组：滑膜上皮增生，局灶可见坏死脱落，可见散在浸润之中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、单核细胞，仍见肉芽肿病变，数量较之前明显减少。见图1。

组别IL-17VEGFIL-1βTNF-α正常对照组804.56±261.92961.95±304.0934.92±11.91497.27±74.25模型对照组914.69±372.751 082.84±189.0639.79±5.24549.09±67.48雷公藤多苷组783.04±313.24878.36±215.4731.19±6.92436.03±116.13透骨香低剂量组538.66±126.462)967.11±262.0932.15±4.662)351.88±74.911)透骨香中剂量组471.32±257.542)698.61±38.571)28.92±3.781)269.78±49.671)透骨香高剂量组257.15±79.621)609.09±122.031)30.79±5.311)201.50±133.051)

与模型对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

图1 踝关节组织病理检查结果(HE，×200)

3 讨 论

RA是目前公认的难治性疾病，往往会导致关节功能障碍且病因复杂，可能与遗传、感染、免疫功能异常等有关，其中由多种免疫细胞产生的炎性细胞因子在疾病调控中起重要作用，关节破坏和滑膜炎症发生是由相互依赖的细胞因子网络调节的。程佳等〔6〕研究表明在RA患者血清及关节滑膜液中，IL-17 表达明显升高。IL-17是辅助性T细胞17分泌产生的一种重要的前致炎细胞因子，具有较强的致炎作用，可导致软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，引起骨侵蚀。同时促进炎症反应发生的IL-1β、TNF-α能够和 IL-17 协同激活 RA 的成纤维滑膜细胞，使前炎症因子表达增多，诱导软骨和成纤维细胞合成与分泌胶原酶、前列腺素等炎性介质，介导滑膜炎性反应和软骨破坏。VEGF是直接作用于血管内皮细胞的有丝分裂原，对血管内皮细胞具有高度特异性，可诱导毛细血管增生 、促进新血管生成等重要的生物学功能。樊有龙等〔 7,8〕从RA患者的血清、关节液及滑膜组织中可检出高水平的 VEGF，并发现血管内皮细胞上VEGF受体表达 VEGF介导的关节损伤是RA发病机制中的重要组成部分。综上，类风湿关节炎患者测定IL-17、IL-1β、TNF-α、VEGF水平变化对诊断病情活动或缓解症状有重要的临床意义，可作为临床判断治疗效果的实验室依据。

本研究结果说明透骨香醇提液对RA有治疗效果。分析其机制可能与透骨香的活性成分水杨酸甲酯糖苷等〔9〕具有祛风除湿、舒筋活络、 活血化瘀和消肿止痛作用〔10〕，其作用机制与下调IL-17、VGEF、IL-1β和TNF-α等炎症介质表达有关。通过上述研究为透骨香的进一步开发利用提供了实验依据，且不良反应较少，患者耐受性较好。