发酵方式对苎麻韧皮生物脱胶效果的影响

冯湘沅，成莉凤，刘正初，杨琦，刘志远，郑科，段盛文，彭源德

(中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205)

苎麻是我国生物质产业最具发展潜力的基础材料之一，其纤维包裹于植株的韧皮部，通过剥皮和刮制获得的产品含有22%～30%的非纤维素物质，经脱胶后才能分离出纤维[1-3]。国内外对苎麻韧皮脱胶普遍采用以烧碱煮炼为中心的化学方法，但由于存在环境污染重，水量消耗大，纤维品质损伤严重等问题，制约了产业进一步发展。生物脱胶具有低能耗、低污染、高品质等特点，是苎麻脱胶的发展方向[4-5]。英国牛津大学、日本早稻田大学、中国农业科学院麻类研究所、武汉大学、华中农业大学等进行了生物脱胶研究，并取得了实质性突破。但由于微生物酶法脱胶存在高成本、难控制等缺陷[6]，很难得到规模化推广，而菌脱胶缺乏优良的脱胶菌株及匹配的脱胶工艺，导致目前菌脱胶尚未形成稳定性生产应用[7-9]。

本文拟采用具有广谱、高效性的DCE01菌株，以湿润、浸泡发酵方式对苎麻韧皮进行生物脱胶，利用半自动纤维分析仪法和柱前衍生-高效液相色谱法对苎麻韧皮生物脱胶产物中半纤维素、纤维素、木质素和水解液中半乳糖醛酸的含量分别进行测定比较[10]，旨在为工厂化生物脱胶节约成本，同时为减少环境污染提供可借鉴的发酵方式。

1 材料与方法

1.1 材料

DCE01菌株:本实验室2009年选育，Dickeya dadantii(保藏号:CGMCC5522)。

原麻:2017年长沙实验基地种植，刮制而成的苎麻韧皮(绕成圈柄状)。

液体培养基组成:蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%、牛肉浸膏0.5%、自来水。

固体培养基组成:营养琼脂3.5%，葡萄糖0.5%、自来水。

1.2 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪(Dionex Ultimate 3000)，泵(LPG-3400)紫外检测器(VWD-3400)，C18柱(Thermo Hypersil BDS，250 mm×4.6 mm，5 μm)，采用变色龙软件采集并处理数据。

FibertecTM2010半自动纤维分析仪(丹麦Foss公司)；TC-4-10型陶瓷纤维炉(北京中兴伟业仪器有限公司)；FZ102型粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；SPX-250B型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；RH-Q型全温振荡器(江苏科析仪器有限公司)。

十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、乙二醇乙醚、磷酸氢二钠、十六烷基三甲基溴化胺、硫酸、三氟乙酸、醋酸铵、1-苯基-3-甲基-吡啉酮(PMP)等均为国药集团化学试剂有限公司产品(分析纯)；乙腈(色谱纯)和半乳糖醛酸为美国Sigma公司产品。

1.3 菌液的培养

取1环抽真空法保存的DCE01菌苔加入5 mL液体培养基中，混匀，35℃、180 r/min培养6 h后，取1 mL培养液稀释涂布于固体培养基平皿，35℃静置培养20 h，长出菌落，挑取典型单菌落接入5 mL液体培养基，混匀，35℃、180 r/min培养4 h后，全部倒入至100 mL液体培养基，35℃、180 r/min培养5 h后，取6 mL培养液接入300 mL液体培养基，35℃、180 r/min培养6 h。

1.4 发酵方式

1.4.1 湿润发酵

参照农业行业标准《苎麻生物脱胶技术规范(NY/T1537—2007)》，取6 mL菌液于装有300 mL自来水的锥形瓶中，混匀，投入30 g苎麻韧皮，浸泡15 min后倒出液体，置于35℃恒温生化培养箱，静止脱胶，设置3个重复。

1.4.2 浸泡发酵

取6 mL菌液于装有300 mL自来水的锥形瓶中，混匀，投入30 g苎麻韧皮，置于35℃、180 r/min全恒温振荡器，振荡脱胶，设置3个重复。

1.5 样品处理

苎麻韧皮接入菌液后从0.5 h开始计时直至10.5 h结束，每隔2 h取样，取出的样品立即经105℃保持20 min，灭活，冷却至室温，取样品用自来水清洗，烘干后获得生物脱胶产物。

将烘干后的生物脱胶产物粉碎，过20目(0.9 mm)筛，收集粉末，测定纤维素、半纤维素、木质素和半乳糖醛酸含量。

1.6 测定方法

(1)纤维素、半纤维素、木质素含量测定采用FibertecTM2010半自动纤维分析仪，参照刘文静等[11-12]测定方法进行。

(2)半乳糖醛酸含量采用柱前衍生-高效液相色谱法，参照冯湘沅等[13-14]测定方法进行。(3)脱除率计算公式为:

脱除率(%)=(脱胶产物初始含量-脱胶产物终止含量)/脱胶产物初始含量×100%(4)方差齐性F检验公式为:

2 结果与分析

2.1 半纤维素含量的变化趋势

由图1可知，从0.5 h开始到10.5 h结束，浸泡发酵方式脱胶产物中半纤维素含量由起始测定时的16.56%下降到脱胶结束时的4.28%，下降12.28个百分点，相当于半纤维素的脱除率为74.15%；湿润发酵方式脱胶产物中半纤维素含量由16.73%下降为4.55%，下降12.18个百分点，相当于半纤维素的脱除率为72.80%。在浸泡及湿润发酵方式脱胶中，苎麻韧皮纤维中的半纤维素含量均随脱胶时间的延长而不断降低，整个脱胶过程中半纤维素含量变化趋势相似。

2.2 果胶降解产物-半乳糖醛酸含量的变化趋势

由图2可知，湿润和浸泡发酵方式进行苎麻韧皮生物脱胶，产物水解液中果胶的降解产物-半乳糖醛酸含量均随脱胶时间的延长而逐渐下降。半乳糖醛酸含量分别由起始0.5 h的30.46 μg/mL(湿润)、30.59 μg/mL(浸泡)下降到 10.5 h 的 5.03 μg/mL(湿润)、4.93 μg/mL(浸泡)，相当于苎麻韧皮中果胶的脱除率分别为83.49%(湿润)和83.88%(浸泡)。

从图1、2可以看出，2.5 h前两种发酵方式脱胶产物中的半纤维素和半乳糖醛酸含量无明显差异，2.5～6.5 h发酵期间，浸泡发酵方式脱胶速度明显比湿润发酵方式快，但6.5 h后两种发酵方式脱胶产物中的半纤维素和半乳糖醛酸含量几乎接近。这说明DCE01菌株在湿润和浸泡发酵方式脱胶过程中均能分泌果胶酶、甘露聚糖酶等脱胶关键酶，从而降解非纤维素物质，且在6.5 h左右顺利完成脱胶。

图1 苎麻韧皮两种发酵方式脱胶产物中半纤维素含量的变化趋势Fig.1 Change trend of hemicellulose content during ramie degumming by two fermentation methods

图2 苎麻韧皮两种发酵方式脱胶产物中半乳糖醛酸含量的变化趋势Fig.2 Change trend of galacturonic acid content during ramie degumming by two fermentation methods

2.3 木质素含量的变化趋势

由图3可知，两种发酵方式脱胶产物中木质素含量均随脱胶时间的延长而不断下降。浸泡发酵方式脱胶产物中木质素含量由起始的0.89%下降到脱胶终止时的0.11%，相当于木质素的脱除率为87.64%；湿润发酵方式脱胶产物中木质素含量则由起始的0.91%下降到终止时的0.13%，相当于木质素的脱除率为85.71%。这一结果为证实刘正初等[7]创立的“块状崩溃”学说提供了科学依据。虽然没有报道DCE01菌株分泌木质素酶，但是在两种发酵方式脱胶过程中可大幅度降低脱胶产物中木质素的含量。

图3 苎麻韧皮两种发酵方式脱胶产物中木质素含量的变化趋势Fig.3 Change trend of lignin content during ramie degumming by two fermentation methods

2.4 纤维素含量的变化趋势

由图4可知，浸泡和湿润发酵方式脱胶产物中纤维素含量均随脱胶时间的延长而不断增加。苎麻韧皮纤维中纤维素含量由0.5 h的71.15%(浸泡)、71.07%(湿润)上升到10.5 h的91.88%(浸泡)、91.56%(湿润)。这说明苎麻韧皮接种DCE01菌液后，两种发酵方式生物脱胶过程中可将半纤维素、果胶和木质素等胶质逐渐剥离，使得生物脱胶产物中纤维素含量上升。

2.5 显著性检验

在选用显著水平α=0.05情况下，分别对浸泡和湿润发酵方式脱胶产物的化学成分(表1)半纤维素、半乳糖醛酸、木质素下降值及纤维素上升值进行方差齐性F检验(表2)，检验结果均满足F样＜F0.05(2.2)，表明两种发酵方式脱胶效果差异不显著。

表1 两种发酵方式脱胶产物的化学成分变化趋势Table 1 The change trend of chemical contends by two fermentation methods

表2 方差齐性F检验数据处理Table 2 The treatment of variance F test data

3 结论

利用DCE01菌株以浸泡和湿润发酵方式对苎麻韧皮进行生物脱胶，结果表明:随着脱胶时间的延长，两种发酵方式对苎麻韧皮纤维进行生物脱胶均能使生物脱胶产物中的半纤维素、木质素、果胶降解产物-半乳糖醛酸含量不断降低，纤维素含量不断增加，变化趋势雷同。接种6.5 h后的果胶、半纤维素、木质素和纤维素含量的变化相对平缓，可以认为此时生物脱胶过程已经完成。

浸泡发酵方式脱胶是将苎麻韧皮浸泡在菌悬液中通过振荡方式发酵进行，而湿润发酵方式脱胶是苎麻韧皮接种倒出菌悬液后通过静止发酵方式进行。两种发酵方式脱胶产物的化学成分变化值经方差齐性F检验数据处理，发现脱胶效果无明显区别。基于这一结果可以推断，生产上采用湿润发酵方式更经济，因为浸泡发酵方式需要通气完成，可能会导致脱胶过程能源消耗更大。