苎麻耐镉种质快速筛选方法研究

陈坤梅，熊和平，朱爱国，陈平，陈继康，高钢，喻春明

(中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205)

土壤镉污染不仅对我国农业生产造成了严重的经济损失，同时也会给人体健康带来风险，加强农田镉污染防治研究具有重要的现实意义。植物修复被认为是友好、经济、环保的方法，故在重金属污染土壤修复中颇受青睐[1-2]。然而，目前所发现的重金属超富集植物大多生长缓慢、生物量低，在恶劣环境下如重金属重度污染土壤上生长受阻，大大影响修复效果[3]。

苎麻又称中国草，是我国古老的天然纤维作物。苎麻对镉具有高耐、高吸收特性，且具备适应能力强、生长迅速、繁殖能力强、生物产量大等优点，弥补了现有超积累植物植株矮小、生长速度慢、受气候影响大、很难实现实际应用价值等不足，具有很好的生态效益[4-5]。苎麻是多年生作物，可免去连年栽种的工序，节约修复成本。此外，苎麻的传统用途是作纤维用，其产品不进入食物链，对人类健康不存在安全隐患。因此，苎麻是修复镉污染土壤的理想植物[6-7]。

当前，利用苎麻修复重金属污染土壤的研究大多集中在耐镉品种筛选[8-9]及镉胁迫下苎麻植株生理生化的变化[10-11]等方面，在品种选育方面的研究滞后。苎麻品种选育主要环节是:根据育种目标选择双亲、人工杂交、F1代单株选择(无性繁殖扩繁F1代单株、调查所选单株的农艺性状表现并结合特定育种目标的性状调查)、小区试验、扩大范围区试试验等[12-13]。由于苎麻结实率高(每个单株所结种子量可达数万甚至更多)，种子较小(千粒重约0.05 g)，将所有杂交F1代种子在地里繁殖，并从数万的种子苗中择优选择，该工序工作量大，选择效率低。因此，在苎麻品种选育中，有必要研究一种或几种快速筛选苎麻种子苗的方法以辅助苎麻品种选育，加速育种进程。苎麻植株对镉的耐受能力是苎麻镉高富集新品种选育所要考察的重要指标，因此，在幼苗期采用适当的方法对苎麻杂交种子苗的耐镉能力进行快速筛选，可加速苎麻镉高富集新品种选育进程。

本研究拟选择3种培养基质，设计不同的镉胁迫浓度，研究苎麻种子苗对镉的耐受能力，比较不同筛选方法的优缺点，综合评价选出适宜的筛选方法，以期为苎麻镉高富集新品种选育前期单株辅助选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中饲苎1号种子为中国农业科学院麻类研究所育成的品种，本研究所用种子为2017年收获。种子收获后晾晒干燥，剥去外壳备用。苎麻是杂合体，又是常异交作物，即使是同一品种所结的种子也会出现一定程度的性状分离，因此本文所用的中饲苎1号种子可作为F1代种子开展耐镉筛选试验。

1.2 试验设计及镉胁迫处理方法

组培筛选试验:选取成熟饱满的苎麻种子，在超净工作台内，先用70%的乙醇浸泡消毒1 min，无菌水冲洗3～4次后，置于0.1%的升汞中浸泡消毒7 min，再用无菌水冲洗3～4次，用滤纸吸干水分，均匀接种于MS(内含0.1 mg/L的NAA)培养基上。室温下用黑布遮光暗处理4 d，然后置于温度25℃，湿度60%～90%，光照强度100～200 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h/12 h的培养室内培养。光照培养16 d后转接至镉浓度分别为0、2.5、5、10、15 mg/L的培养基中，每个浓度接种4瓶，每瓶2株。期间观察记录种子苗的生长情况、统计死亡率。

水培筛选试验:该试验在培养皿中进行，先是在培养皿内放一层棉花，棉花上面铺设两层滤纸，每个培养皿用等量的镉溶液润湿(对照用去离子水代替)。苎麻种子去掉外壳后均匀散播于培养皿中，每皿播100粒种子，于温室下培养。每天观察记录表型，统计发芽数并测定主根长。根据滤纸的干燥程度，用移液枪向每个培养皿中加入等量对应浓度的镉溶液(对照用去离子水代替)，保持滤纸一直呈湿润状态。预试验中，镉浓度设置为0、10、50、100、150、200 mg/L；正式试验镉浓度调整为0、5、10、20、50、100 mg/L。 处理期间统计种子苗的发芽率，测定根长。

土培筛选试验:该试验用蛭石培养苎麻种子苗，蛭石称重后放入育苗盘(钵，长、宽、高分别为7、7、8 cm)，育苗盘下垫一托盘，自育苗盘底部加水，待蛭石完全吸水润湿后将中饲苎1号种子均匀散播于每个育苗盘中，盖上保鲜膜，置于温室下培养，5～7 d后种子萌发，萌发3 d后揭开保鲜膜。自种子播种算起13 d后用镉处理，先将镉溶解于水，镉溶液加至托盘内，自育苗盘底部吸入镉溶液。该试验设置了预试验(起始镉浓度为40 mg/kg，后调整为120 mg/kg)、二次试验(镉浓度分别为 0、40、80、120、160、200、400 mg/kg)和三次试验(镉浓度分别为 0、500、1000、2000、4000、8000 mg/kg)。处理期间记录种子苗表型变化。

1.3 数据分析

数据采用excel计算处理，用SPSS 19.0进行显著性分析，采用LSD比较处理和对照的差异性，采用Sigma 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 组培试验筛选结果

由图1可知，镉胁迫15 d后，苎麻组培种子苗的生长受到抑制，镉胁迫浓度越高抑制程度越大，表现为麻苗植株矮小，根系少而短；镉胁迫21 d后，处理浓度≤5 mg/L的麻苗仍能生长，但叶片失绿，当镉浓度≥10 mg/L时，麻苗生长受到严重抑制，叶片失绿严重，尤其是在高浓度(15 mg/L)处理下，麻苗叶片出现白化的现象，植株几近死亡。

图1 镉胁迫对苎麻组培种子苗的影响Fig.1 Effect of ramie seedling under cadmium treatment

2.2 水培试验筛选结果

首先设置了≤200 mg/L的镉浓度梯度进行预试验，发现种子点播4 d后，对照组中大部分种子(大于80%)能萌发并生根，叶片绿色；10 mg/L浓度处理的种子约50%能萌发并生根，但叶片略黄；50 mg/L浓度处理的种子约有30%能萌发；100 mg/L浓度处理的种子仅10%露出白芽；镉浓度≥150 mg/L处理的种子未见萌发趋势(见图2A)。据此，重新设置了≤100 mg/L的镉浓度开展后续试验，结果发现低镉浓度(≤5 mg/L)处理下苎麻种子发芽率与对照相当，说明低镉浓度胁迫对苎麻种子发芽率影响不大；镉浓度≥10 mg/L时，严重影响苎麻种子发芽率，浓度越高发芽率越低；在50 mg/L浓度下处理13 d后，其发芽率较之处理7 d的发芽率有所降低，说明部分种子苗在镉胁迫下死亡；在高浓度(100 mg/L)下，种苗在处理13 d后全部死亡(见图2B、3A)。另外，镉胁迫显著影响苎麻种子苗根系的发育，随着胁迫浓度的增加，根长逐渐变短(见图3B、4)。

2.3 土培试验筛选结果

预试验发现，120 mg/kg的镉浓度处理下，苎麻种子苗叶片发黄，但仍能生长，未能达到筛选的目的(见图5)。调整镉胁迫浓度开展二次试验，结果发现，镉浓度增至400 mg/kg后，苎麻种子苗长势虽比对照弱小，但并未致死，仍未达到筛选的目的(见图6)。继续调整镉胁迫浓度开展三次试验，结果发现，随着处理浓度的增加，苎麻种子苗生长逐渐变弱，高浓度(≥4000 mg/kg)处理下麻苗叶片出现萎蔫症状，尤其在8000 mg/kg浓度处理下，大部分麻苗死亡，存活的少量麻苗即认为是耐镉能力强的种苗(见图7)。

图2 镉胁迫对苎麻种子萌发的影响Fig.2 Effect of germination in ramie seeds under cadmium treatment

图3 镉胁迫下苎麻种子发芽率(A)及种子苗根长(B)Fig.3 Germination rate of ramie seeds(A)and root length of ramie seedlings(B)under cadmium treatment

图4 镉胁迫13 d后苎麻种子苗Fig.4 Ramie seedlings under cadmium treatment for 13 days

图5 土培苗耐镉筛选预试验Fig.5 Pre-screening experiment for cadmium tolerant seedlings of ramie in soil

图6 土培苗耐镉筛选二次试验Fig.6 Secondary screening experiment for cadmium tolerant seedlings of ramie in soil

3 讨论

种苗筛选是苎麻育种过程中的重要一环。以往对苎麻杂交F1代种子的筛选多在田间进行，一般2月份左右播种，1个多月后麻苗出土，经过1～2个月炼苗期，可根据育种目标鉴定、移栽。该方法周期长，人工成本高，并且受自然条件影响较大。苎麻种苗耐镉筛选尚未有先例可循，寻找可用于种苗快速简便的筛选方法，可极大地加速苎麻耐镉品种选育进程。

通过组培筛选，较低的镉浓度处理麻苗即出现较明显表型，达到筛选的目的。但是，组培的方法对操作的技术要求较高，每个环节(如培养基配制、种子消毒处理、接种、麻苗转接等环节)的处理需专业的技术人员来完成，并且如果需要大量的种子筛选，组培工作量较大，成本也相应增加。另外，组培筛选从接种到表型鉴定至少需40 d，时间较长，因此，该方法不适用于大量种苗筛选。

图7 土培苗耐镉筛选三次试验Fig.7 Third screening experiment for cadmium tolerant seedlings of ramie in soil

水培的方式常被用于多种作物如玉米[14]、小麦[15]、水稻[16]耐镉种苗的筛选，该方法简便易行，可快速鉴别所筛选作物种子发芽率、发芽指数、种苗根长等指标。本研究水培筛选试验中，50 mg/L镉浓度处理的种子苗，在处理13 d后部分苗死亡，存活的麻苗即认为是镉高耐的种苗，但其根系较短(＜1 cm)，移栽至土里不易存活；而20 mg/L镉浓度处理的种子，其存活的麻苗根系在1～2 cm之间，移栽至土中比用50 mg/L镉浓度处理的种子苗易于存活。因此，若用水培的方法筛选耐镉苎麻种子苗，建议用20 mg/L镉的浓度。水培筛选的方法简单易行、成本低，处理7～13 d就可鉴定表型，达到筛选的目的。

采用土培筛选，自种子点播起30 d内便出现明显表型，达到筛选目的。该方法快速、简便，由于本就在固体介质中筛选，筛选出的种苗再移栽至土壤中也易于存活。但该方法筛选所用的镉浓度较高，实施时应注意采取措施避免镉对周围环境的污染。

4 结论

组培、水培和土培这三种方法筛选镉高耐性苎麻种子苗各有利弊。考虑到筛选的时效和成本，以水培和土培筛选为佳，其中，土培筛选法其种苗移栽更易存活，有利于后续的繁种环节。因此，本研究认为通过土培的方式可快速有效筛选出镉高耐性的苎麻种子苗。