一株大麻脱胶菌株的分离鉴定及其产果胶酶发酵培养基的优化

徐鹏，王大红，陈亚欣，王泽轩，王子旭，魏来红，刘高

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023)

大麻(Cannabis sativa)为一年生大麻属草本植物，其纤维性能优异，有吸湿排汗、透气性好、防紫外辐射、抑制霉菌、防臭等优点，是一种应用潜力巨大的环保型纤维原料[1]。大麻纤维被包埋于茎秆的韧皮部，纤维细胞在胞间层物质的黏结下交织成网状，并与半纤维素等呈化学健合。大麻纤维与纤维之间、纤丝系统之间和链状分子团系统之间含有大量的胶质，这些胶质中半纤维素含量最高，其次是木质素和果胶，如果用于纺织原料，必须适度去除韧皮部的果胶、半纤维素和木质素等非纤维物质[2]。因此，为合理利用大麻，必须对大麻进行脱胶处理。大麻脱胶的实质是采取各种方法破坏纤维束与周围组织、韧皮部与表皮、韧皮部与木质部之间的连接。由于大麻纤维过短(7～50 mm)，且纤维整齐度差，若全脱胶会造成短绒而失去可纺性，因此在除去胶质的同时，要减少对纤维细胞间胶质的破坏。脱胶质量的好坏直接影响麻纤维的产量和质量[3]。

大麻脱胶的方式主要有化学法、物理法和生物法。化学法是利用大麻纤维中的胶质和纤维素对烧碱作用的稳定性差异去除原麻中的胶质，保留纤维素成分。物理法是利用具有高能量的介质，瞬间释放能量，打断大麻纤维的化学键，起到脱胶的作用[4]。生物脱胶主要是用微生物或酶去除大麻中果胶等非纤维素物质，主要有冷水沤麻、雨露沤麻和堆积发酵等脱胶方式[5]。大麻生物脱胶方法与物理和化学脱胶方法相比，具有低能耗、环保，生产出的纤维质量好等特点，是一种较理想的脱胶方式[6]。目前，大麻生物脱胶所利用的微生物主要为细菌和真菌。一些研究者分离出贝氏芽孢梭菌、嗜果胶芽孢梭菌等厌氧脱胶菌[7]。而好氧脱胶菌主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属和微球菌属。杨田等[8]分离和鉴定2株大麻脱胶菌为枯草芽孢杆菌；Das等[9]用Bacillus sp.和B.pumilus菌联合对黄麻进行脱胶，缩短了脱胶时间，并提高了麻纤维的质量。生物脱胶作为一种绿色的麻纤维脱胶方法，是未来大麻脱胶的一种重要方式。目前报道的生物脱胶方法在亚麻、苎麻等工业化应用中比较成功，但大麻生物脱胶还未工业化。本文拟从沤麻的水体中筛选具有脱胶功能的细菌，采用生理生化特征与16S rDNA相结合的方法对最优菌株进行菌种鉴定，并对其产果胶酶培养基进行优化，旨在为大麻微生物脱胶奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大麻由河南省固始县坤源麻业有限公司提供；水样取自河南省固始县沤麻的水体。

1.2 培养基

富集培养基:大麻5 g/L，NH4NO33 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO41 g/L，CaCl20.2 g/L。 大麻的长度为5～6 cm，经过2 g/L的硫酸溶液室温下浸泡24 h后，冲洗干净。

分离培养基:果胶 5 g/L，NH4NO33 g/L，FeSO40.01 g/L，KH2PO41 g/L，CaCl20.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂 20 g/L，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0～7.2。

种子培养基:葡萄糖15 g/L，酵母膏7 g/L，NaCl 0.9 g/L，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

发酵培养基:葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，果胶2 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH 7.0。

1.3 试验方法

1.3.1 富集培养

采集的水样置于50℃水浴中处理30 min，取10 mL水样加入90 mL灭菌后的富集培养基中，30℃、200 r/min恒温培养7 d。

1.3.2 初筛和复筛

对富集培养液进行梯度稀释，取各稀释度菌悬液0.2 mL分别涂布于分离培养基，置于30℃恒温箱中培养，至菌落长出。挑取单菌落，反复培养、纯化，获得菌株。每个菌株接入种子培养基中，30℃、200 r/min恒温培养1 d，然后按5%的接种量接入发酵培养基中，30℃、200 r/min恒温培养3 d，测定其果胶酶酶活。

1.3.3 细菌形态学观察

细菌接种于LB平板上，培养3 d，观察细菌的菌落特征和形态，扫描电镜观察菌体细胞特征。

1.3.4 生理生化特征的测定

具体试验操作见《常见细菌系统鉴定手册》[10]。

1.3.5 细菌16S rDNA基因测序以及序列分析

16S rDNA序列 PCR扩增采用细菌通用引物 27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[11]。PCR产物由上海生工生物工程有限公司完成测序。测序后，将该菌株序列在NCBI数据库中Blast比对，选择同源性较高的参比菌株及序列，使用Mega7.0软件构建系统发育树。

1.3.6 果胶酶酶活的测定

DNS法测定果胶酶活力[12]。0.5 mL 0.25%果胶溶液和0.5 mL稀释的酶液加入25.0 mL比色管中，然后再加入l mL pH 6.8的磷酸缓冲液，50℃保温30 min。加入2 mL DNS试剂，煮沸5 min，冷却定容至20 mL。混匀后540 nm下测定吸光度，根据葡萄糖标准曲线计算出还原糖含量(以半乳糖醛酸计)，以有底物无酶样品做对照。规定每小时每毫升酶转化果胶生成1 ug还原糖(以半乳糖醛酸计)需要酶的量为1个酶活单位(U)。根据葡萄糖和半乳糖醛酸之间的关系，计算发酵液中果胶酶活力，计算公式如下，其中A代表还原糖含量(mg/mL)。

半乳糖醛酸的量(μg/mL)=A×1000×194/180

酶活(U/mL)=A×1000×194×2/180

1.3.7 碳源、氮源和无机盐的筛选与优化

分别选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、马铃薯淀粉、玉米淀粉、L-山梨糖、大豆油、果糖和丙三醇为碳源，选取酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉、玉米浆、硝酸铵、硝酸铵、丙氨酸为氮源，选取磷酸二氢钾、硝酸钾、氯化锌、氯化钙、硫酸铁、硫酸镁、氯化钠和氯化铜等为无机盐，考察不同碳源、氮源和无机盐对产果胶酶的影响，进而选择最佳碳、氮源和无机盐进行正交试验，优化发酵培养基组成。

1.3.8 菌株的脱胶试验

称取50 g原麻，按质量比1∶15的比例加入发酵后的粗酶液中，50℃下脱胶24 h，然后使用0.2%NaOH、0.2%Na3PO4和0.1%Na2SO3混合液进行化学煮炼。

1.3.9 残胶率的测定

将质量为G1的大麻放入100 mL浓度为2%的NaOH溶液中，121℃高压灭菌30 min，而后反复水洗，烘干后称重记为G2，计算公式为:

残胶率(%)=[(G1-G2)/G1] ×100%

2 结果与分析

2.1 果胶酶产生菌的分离

通过果胶平板的筛选，从5份水样分离得到14株细菌，分别编号为X-1、X-2…X-14，从图1中可以看出14种菌的产果胶酶能力，其中X-6菌的产果胶酶能力最强，达到330 U/mL。

由图2可知，X-6菌在LB固体培养基中菌落隆起，呈淡黄色，边缘清楚，表面湿润、光滑，革兰氏染色呈阴性。在扫描电镜下(见图3)，细胞为短杆状，大小为0.6～0.8 μm×2～3 μm。

图1 果胶酶产生菌株的筛选Fig.1 Screening strains producing pectinase

图2 大麻脱胶菌X-6的菌落形态Fig.2 The colony form of degumming strain X-6

图3 X-6菌的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron micrograph of X-6 strain

2.2 X-6菌的生理生化特征

由表1可知，X-6菌株能利用葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖和麦芽糖等糖，不能利用海藻糖和D-甘露糖，X-6菌株在温度为15～40℃、pH 6.0～10.0之间均能生长，氧化酶和接触酶试验阳性。

表1 X-6菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of X-6 strain

2.3 X-6菌的分子生物学鉴定

16S rDNA基因序列与 GeneBank数据库进行BLAST比对，X-6菌株与产碱假单胞菌NR113646.1的16S rDNA基因序列相似性为97%(见图4)。并根据其形态、生理生化特征和《伯杰氏细菌鉴定手册》，该菌株经鉴定并被命名为产碱假单胞菌X-6(Pseudomonas alcaligenes X-6)。

图4 X-6菌的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of X-6 strain

2.4 发酵培养基成分的筛选

2.4.1 碳源筛选

发酵培养基中其它组分不变，以各碳源(5 g/L)代替原发酵培养基中的碳源。由图5可知，马铃薯淀粉为碳源时果胶酶活力最高，为394 U/mL，说明该菌能够产生淀粉酶，其次为葡萄糖和玉米淀粉，其为碳源时果胶酶活力分别为362、358 U/mL。因此马铃薯淀粉和葡萄糖为其最优碳源。

图5 不同碳源对果胶酶活性的影响Fig.5 Effect of different carbon sources onpectinase activity

2.4.2 氮源筛选

发酵培养基中其它组分不变，以不同氮源(7 g/L)分别代替原发酵培养基中的蛋白胨和酵母膏。由图6可知，以玉米浆为氮源的培养基果胶酶产量最高，达422 U/mL，其次是酵母粉，为385 U/mL，因此选定玉米浆和酵母粉为氮源。

图6 不同氮源对果胶酶活性的影响Fig.6 Effect of differen tnitron sources on pectinase activity

2.4.3 无机盐筛选

发酵培养基中其它组分不变，将8种无机盐分别加入发酵培养基中代替原培养基中的无机盐。从图7可以看出，氯化钙和氯化钠对果胶酶的产生有较大的促进作用，分别达到458、432 U/mL，而氯化锌、硫酸铁和氯化铜对果胶酶的产生有抑制作用，说明对果胶酶的产生有促进作用的为钙离子和钠离子。因此，选用氯化钙和氯化钠作为果胶酶发酵培养基的无机盐。

图7 不同的无机盐对果胶酶活性的影响Fig.7 Effect of different inorganic salt on pectinase activity

2.4.4 正交试验

培养基中的碳源、氮源和无机盐经单因子试验后，考虑到不同因子之间的交互作用，对单因素确定的碳源(马铃薯淀粉、葡萄糖)、氮源(玉米浆、酵母粉)、无机盐(氯化钙、氯化钠)进行正交试验设计(L18(36))，因素水平见表2，结果见表3。

表2 正交设计因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交试验Table 3 Orthogonal experiment

续表3

从表3中可以看出，6种因素对果胶酶产生的影响顺序为:玉米浆＞葡萄糖＞酵母粉＞马铃薯淀粉＞氯化钙＞氯化钠。最佳培养基配比为A3B2C3D3E3F1，即葡萄糖5 g/L，马铃薯淀粉4 g/L，酵母粉4 g/L，玉米浆4 g/L，氯化钙1.5 g/L，氯化钠0.5 g/L。经过5次平行验证实验，在该条件下果胶酶的平均酶活达到586 U/mL。

2.5 大麻脱胶试验

根据正交试验优化的培养基组成对X-6菌进行发酵，发酵结束后采用发酵液对大麻进行脱胶试验，结果见图8，从图中可以看出，脱胶后大麻纤维质地均匀，光泽好，颜色较白，残胶率由38.9%降低至17.2%，果胶去除率较高，脱胶效果较好。

图8 生物脱胶大麻纤维Fig.8 The hemp fiber after biological degumming

3 讨论

大麻脱胶即是将韧皮部的果胶、半纤维素等成分去除，从而释放大麻纤维，整个脱胶过程应尽量减少破坏纤维细胞，使纤维具有可纺性。传统的化学脱胶法出麻率低，环境污染严重，麻纤维损伤严重[13]。天然水沤麻脱胶时间长，劳动强度比较大，对水体污染严重，麻纤维质量不稳定。因此，采用微生物脱胶法，分离出具有高果胶酶、半纤维素酶、木质素酶活性及低纤维素酶活性的微生物菌株非常重要。目前分离出的麻类脱胶菌包括梭状细菌、芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉等。目前，微生物脱胶后的精干麻一般仍然含有较多的胶质，无法直接应用于工业生产，仍需辅以化学方法进一步脱胶[14]。

在本研究中，采用果胶作为唯一碳源的平板，从沤麻的水体中分离到14株具有果胶酶生产能力的细菌，其中X-6菌果胶酶活力达到330 U/mL，通过生理生化特征和16S rDNA序列比对，该菌株被命名为Pseudomonas alcaligenesX-6。通过单因素和正交试验优化该菌的发酵果胶酶培养基组成，果胶酶活力达到586 U/mL。通过大麻的脱胶试验，该菌株产生的粗酶液对大麻脱胶效果较好。在大麻生物脱胶过程中，很多因素会影响脱胶效果，如脱胶的温度、pH、离子的种类和强度等，本研究中只探讨了该菌株产果胶酶的能力，而其产半纤维素酶、木质素酶和纤维素酶的能力没有研究，这些酶同样是影响微生物脱胶能力的重要指标。王建玲等[15]对碱性果胶酶基因工程菌(pWB980-pel521/WB600)的发酵培养基进行优化，酶活力达到760 U/mL；望潇文等[16]将工程菌株B.subtilis168在5 L的发酵罐中进行高密度发酵，果胶酶酶活达到2271 U/mL。与国内报道的其它菌株相比，Pseudomonas alcaligenesX-6菌株的果胶酶活力较低，工业化应用时，还需进一步提高其产酶能力。因此，下一步的研究主要测定Pseudomonas alcaligenesX-6菌株与脱胶能力有关的其它参数，并对该菌株进行菌种选育与产酶条件优化，提高其产酶性能，为工业化应用提供基础。