2-甲氧基雌二醇对多种肿瘤细胞的体外抑制作用研究

李银英

(郑州大学第二附属医院药学部，河南 郑州 450052)

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是雌激素的内源性代谢产物,但对雌激素受体的亲和力较低,而且对多种肿瘤细胞具有抑制作用。由于该药只作用于增殖活跃的细胞,而对静止细胞无作用，所以不良反应较轻。近年来，通过大量的体内外研究[1-4]发现，2-ME具有抗多种恶性肿瘤的作用，其中包括肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、骨髓瘤以及白血病等。大量研究[3-4]证明2-ME的作用机制主要为诱导细胞凋亡、抑制细胞的增生、抗新血管的生成、抑制微管的功能等，具有成为抗肿瘤药物的潜力，本实验旨在研究其对多种肿瘤细胞的增殖抑制率。

1 材料与方法

1.1 实验材料细胞系人食管癌细胞EC-9706、人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞SMMC-7721、人肝癌细胞HepG-2、人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人前列腺癌细胞PC-3、人宫颈癌细胞HeLa、人乳腺癌细胞MCF-7，均为贴壁生长的细胞，均购自中国医学科学院上海细胞生物研究所，并在郑州大学药学院长期传代培养。

试剂与仪器：E191型CO2培养箱，美国SIM公司；倒置显微镜，德国Leica公司；U410型超低温冰箱(-80 ℃)，美国NBS公司；96孔细胞培养板，美国Coming Costar公司；Spectra MR型全波长酶标仪，美国DYNEX公司；2-ME，郑州大学药学院化学试验室合成；DMEM培养基，郑州科诺生物技术有限公司；RPMI-1640培养基，郑州科诺生物技术有限公司；优级胎牛血清，上海依科赛生物制品有限公司；磺酰罗丹明B(SRB)，美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)，北京Solarbio公司；胰蛋白酶，美国Sigma公司；三氯乙酸(TCA)，郑州科诺生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 从液氮或-80 ℃冰箱中取出冻存的肿瘤细胞，迅速置于接近37 ℃的温水中，边摇边振荡，使其在数秒内完全解冻，然后将其转移到离心管内离心(1000 r·min-1，5 min)，弃去上清液，加入适量培养基，吹打成单细胞悬液，转移到细胞培养瓶中，置37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。当细胞生长到占培养瓶体积80%～90%时，用质量分数0.25%胰酶(不含乙二胺四乙酸)对细胞进行传代，选对数生长期的细胞进行试验。

1.2.2 SRB法检测2-ME对多种肿瘤细胞的体外抑制作用

1.2.2.1 2-ME对EC-9706、SK-N-SH、SH-SY5Y细胞的体外抑制作用检测[5]取处于对数生长期的EC-9706细胞，质量分数0.25%胰酶消化收集，调整细胞浓度，5×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后弃去培养基，实验组加入不同浓度的2-ME(0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1)，每孔反应体系0.2 mL，空白对照组以RPMI-1640培养基补足，溶剂对照组DMSO浓度为20 μmol·L-1，每组设6个复孔，继续分别培养24、48、72 h后，倒置显微镜下形态学观察并照相，用预冷的TCA固定10 min，移入4 ℃条件下静置1 h后，倒掉固定液，每孔用去离子水洗5次，自然晾干，于干燥的每小孔中加入100 μLSRB染色，室温避光放置15 min，弃去染液，用质量分数1%冰醋酸将未结合的SRB染液洗去，每孔5遍，自然晾干。结合的SRB用Tris碱液150 μL溶解，摇床上放置15～20 min后，用全自动酶标仪在515 nm处测定每孔光密度(OD)值，用下列公式计算细胞增殖抑制率[6]：细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2.2 2-ME对SGC-7901、SMMC-7721、HepG-2细胞的体外抑制作用检测 取处于对数生长期的SGC-7901、SMMC-7721、HepG-2细胞按照1.2.2.1的方法进行处理，然后将细胞以5×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后弃去培养基，实验组加入不同浓度的2-ME，终浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1，每孔反应体系0.2 mL，空白对照组以RPMI-1640培养基补足，溶剂对照组DMSO浓度为16 μmol·L-1，每组设6个复孔，继续分别培养24、48、72 h后，按照1.2.2.1方法继续处理细胞。

1.2.2.3 2-ME对PC-3、HeLa、MCF-7细胞的体外抑制作用检测 用含体积分数10%胎牛血清、青链霉素混合液的RPMI-1640培养基将PC-3、HeLa、MCF-7细胞培养至对数生长期，然后质量分数0.25%胰酶消化收集，因为此3种细胞生长速度较慢，所以96孔板每孔接种浓度为6×103个/孔，后续操作按照1.2.2.1的方法。

2 结果

2.1 2-ME对EC-9706细胞的体外抑制作用2-ME对EC-9706细胞的体外抑制作用随药物浓度和作用时间变化而变化，在作用24 h时抑制作用不明显，作用48 h和72 h时抑制作用明显，且呈现很好的时间和浓度依赖性。2-ME作用时间为48 h和72 h的半抑制浓度(50% inhibitory concentration，IC50)分别为7.210、8.598 μmol·L-1。见表1、图1。

表1 2-ME对EC-9706细胞的体外抑制作用

图1 2-ME对细胞EC-9706的抑制作用

2.2 2-ME对SGC-7901细胞的体外抑制作用2-ME在作用时间为24 h时对SGC-7901细胞无明显抑制作用，最大抑制率出现在10 μmol·L-1，数值为22.5%；当2-ME作用时间为48、72 h时，对SGC-7901细胞的抑制非常明显，并呈现很好的时间浓度依赖性。2-ME作用时间为48 h和72 h的IC50分别为2.762、0.231 μmol·L-1。见表2、图2。

表2 2-ME对SGC-7901细胞的体外抑制作用

图2 2-ME对SGC-7901细胞的体外抑制作用

2.3 2-ME对SMMC-7721、HepG-2细胞的体外抑制作用2-ME对SMMC-7721细胞作用时间为24、48、72 h时，最高抑制率均出现在最大浓度点20 μmol·L-1，抑制率分别为29.0%、55.0%、72.5%，整体上在作用24 h时抑制作用不明显，作用48 h和72 h时抑制作用明显，且呈现很好的时间和浓度依赖性。2-ME对SMMC-7721细胞48 h和72 h的IC50分别为7.871、1.453 μmol·L-1(表3、图3)。2-ME对HepG-2细胞在药物作用时间为24、48、72 h时，最高抑制率均出现在最大浓度点20 μmol·L-1，抑制率分别为36.6%、52.9%、79.4%，整体上在作用24 h时抑制作用不明显，作用48 h和72 h时抑制作用明显，也呈现很好的时间和浓度依赖性。2-ME作用HepG-2细胞48 h和72 h的IC50分别为6.785、0.781 μmol·L-1(表4、图4)。

表3 2-ME对SMMC-7721细胞的体外抑制作用

表4 2-ME对HepG-2细胞的体外抑制作用

图3 2-ME对SMMC-7721细胞的体外抑制作用

图4 2-ME对HepG-2细胞的体外抑制作用

2.4 2-ME对SK-N-SH、SH-SY5Y细胞的体外抑制作用2-ME对SK-N-SH细胞作用时间24 h时，最大抑制率是出现在最高浓度点的，抑制率为28.0%；而在2-ME作用时间为48 h和72 h时，最好抑制效果则分别出现在浓度为1.25、2.5 μmol·L-1时，抑制率分别为72.2%、73.4%；在出现最大抑制效果后，抑制率则变化平稳，在5、10、20 μmol·L-1这3个浓度点抑制率相近，48h时3个浓度点抑制率分别为55.6%、54.7%、55.3%，72 h时则分别为53.7%、54.3%、57.2%。整体上在作用24 h时抑制作用不明显，作用48 h和72 h时抑制作用明显。2-ME作用时间48h和72h时的IC50值分别为1.961、1.263 μmol·L-1(表5、图5)。2-ME对SH-SY5Y细胞的抑制，在作用时间为24、48、72h时最大抑制率均出现在最高浓度，分别为30.9%、57.5%、65.6%。整体上在作用24 h时抑制作用不明显，作用48h和72h时抑制作用明显，其作用基本遵循时间和浓度依赖性。2-ME作用SH-SY5Y细胞48 h和72 h的IC50分别为5.837、2.354 μmol·L-1(表6、图6)。

表5 2-ME对SK-N-SH细胞的体外抑制作用

表6 2-ME对SK-SY5Y细胞的体外抑制作用

图5 2-ME对SK-N-SH细胞的体外抑制作用

图6 2-ME对SK-SY5Y细胞的体外抑制作用

2.5 2-ME对PC-3、HeLa、MCF-7细胞的体外抑制作用2-ME在浓度为2.5 μmol·L-1之前，对PC-3细胞抑制率随浓度的变化而变化幅度较大，但是在2.5 μmol·L-1之后，抑制率随浓度变化较为平稳，24、48、72 h这3个时间点抑制率随浓度的变化趋势较为一致，在作用24 h时抑制作用不明显，作用48 h和72 h时抑制作用明显。2-ME作用48、72 h时对PC-3细胞的IC50分别为5.223、3.96 1μmol·L-1(表7、图7)。2-ME对HeLa细胞在作用24 h时抑制作用不明显，作用48 h和72 h时抑制作用明显，且呈时间和浓度依赖性，2-ME作用HeLa细胞48 h和72 h的IC50分别为3.276、1.897 μmol·L-1(表8、图8)。2-ME对MCF-7细胞在作用24 h时抑制作用不明显，作用48 h和72 h时抑制作用明显，且呈时间和浓度依赖性。2-ME作用MCF-7细胞48 h和72 h的IC50分别为2.963、2.891 μmol·L-1(表9、图9)。

表7 2-ME对PC-3细胞的体外抑制作用

表8 2-ME对HeLa细胞的体外抑制作用

表9 2-ME对MCF-7细胞的体外抑制作用

图7 2-ME对PC-3细胞的抑制作用

图8 2-ME对HeLa细胞的抑制作用

图9 2-ME对MCF-7细胞的抑制作用

3 讨论

2-ME已经被证实在体外对肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、骨髓瘤以及白血病等多种肿瘤细胞具有抑制作用，且只作用于增殖活跃的细胞，而对静止细胞无明显作用，2-ME的作用机制主要为诱导细胞凋亡、抑制细胞的增生、抗新血管的生成、抑制微管的功能等[5-10]。几种2-ME的药物的临床前和临床试验均显示出了较好的耐受性，但是其较低的生物利用度限制了其在临床中的应用，因此，下一步的研究主要集中在如何提高其生物利用度方面[7-14]。本研究证实，2-ME在体外对食管癌、胃癌、肝癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用，且呈不同程度的时间和浓度依赖性，但是并不是在所有浓度区间都呈浓度依赖性的。2-ME对EC-9706细胞的体外抑制随随药物浓度和作用时间变化而变化，48 h和72 h时明显高于24 h，但48 h和72 h时却无显著差别，甚至48h时的IC50略低于72 h；2-ME 对SMMC-7721细胞作用时间为24、48、72 h时，最高抑制率均出现在最大浓度点20 μmol·L-1，而且每组都呈现很好的浓度依赖性；2-ME对SK-N-SH细胞的体外抑制效果虽然很好，但是并不遵循很好的时间和浓度依赖性，而是在不同作用时间的不同浓度点出现最大抑制效果，在作用24 h时最大抑制率出现在最高浓度点，抑制率为28.0%，而在2-ME作用时间为48、72 h时最好抑制效果则分别出现在浓度为1.25、2.5 μmol·L-1时，抑制率分别为72.2%、73.4%；在出现最大抑制效果后，抑制率则变化平稳，在5、10、20 μmol·L-1这3个浓度点，抑制率并无较大差别。2-ME对HeLa细胞的体外抑制作用是非常明显的，表现出很好的时间和浓度依赖性，但是在作用时间48、72 h时，10 μmol·L-1浓度点的抑制率均大于20 μmol·L-1，不同于10 μmol·L-1之前抑制率随浓度的变化；2-ME作用于MCF-7细胞时，48、72 h时实验数值差别不大，甚至48 h时在浓度点0.625 μmol·L-1之后，其抑制率都略高于72 h，这一结果表明，48 h之后，2-ME对MCF-7细胞的抑制率随时间变化不太明显，而对SGC-7901细胞的抑制对时间和剂量的依赖显著。总之，2-ME能够在体外抑制上述肿瘤细胞的增殖，且作用呈一定的时间和浓度依赖性，但是其具体作用机制尚需进一步深入研究阐明。