乳酸细菌转化甘蔗糖蜜为乳酸等有机酸的研究

李慧敏，王新南，王家林，张晓冬，刘全兰*

1. 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院（青岛 266042）；2. 山东省农作物种质资源中心（济南 250100）

乳酸是Scheele C. W.于1780年在酸奶中发现，1881年Fermi发酵法获得，直至2012年，全球乳酸产量达到259 000吨 t[1]，现广泛应用到食品、药品、化妆品、建材及畜牧业等行业。乳酸多通过乳酸菌发酵碳水化合物来生产，乳酸产物的纯度会因菌株、碳水化合物成分、发酵时间的不同而出现变化。最近研究表明乳酸菌在发酵液中能形成乳酸、乙酸等C2～C5短链脂肪酸，它们可在污水处理的碳源供给中发挥重要作用，Tang等[2]把食品废水的乳酸发酵液添加到污水中，可有效去除其中的氮，脱氮率为5.5 mg NOx-N/（g-VSS h）；刘智晓等[3]将污泥发酵形成的乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异戊酸等（C2～C5）短链脂肪酸逆向应用于污泥，不仅有效地提高除磷脱氮效率，还降低了污水厂的污泥产量。因此，乳酸菌发酵液中的乳酸或乳酸、乙酸等C2～C5短链脂肪酸将在工业生产中发挥积极的作用。

甘蔗糖蜜来源于甘蔗的制糖工艺，其主要成分为可发酵性糖类，约占50%[4]；因其含有丰富的微量元素、维生素、矿物质及生长因子等，可为微生物生长提供充足的营养物质。在实际生产中，甘蔗糖蜜可发酵生产乳酸、酒精、焦糖色素等[5-6]。试验选用6株乳酸菌发酵甘蔗糖蜜来生产乳酸等C2～C5短链脂肪酸，并通过发酵培养基中糖分配比的调控、有机酸的定性和定量、甘蔗糖蜜的糖消耗率来分析乳酸菌利用甘蔗糖蜜生产乳酸、乙酸的能力，为甘蔗糖蜜的乳酸发酵液来生产乳酸或乳酸、乙酸等的C2～C5短链脂肪酸提供应用数据，筛选出高效发酵甘蔗糖蜜的菌株以用于将来的工业化应用。

1 材料及方法

1.1 材料及仪器试剂

试验菌株分离筛选于苜蓿、市售牡蛎、市售酸奶，选取溶钙圈较大的菌株，分别为编号MX1、MX4，ML7、ML11，SN2、SN3，保存于青岛科技大学精细楼基因资源室。

试验所采用的MRS培养基和葡萄糖发酵培养基，见参考文献[7]，采用的鉴定培养基成分见参考文献[8]。甘蔗糖蜜，青岛磐石糖业商贸有限公司。甘蔗糖蜜发酵培养基的150 g/L碳源为甘蔗糖蜜与葡萄糖按照5个不同质量比例（0:1，1:1，2:1，3:1和1:0）配置，其余成分同葡萄糖发酵培养基，分别编号为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ。

试验所采用的YQX-11型厌氧培养箱及SW-CJ-IF型超净工作台购自上海新苗医疗器械制造有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；高效液相Waters Alliance 2695测定仪购自美国沃特世科技有限公司。

1.2 甘蔗糖蜜的发酵

1.2.1 菌株发酵类型的鉴定

采用鉴定培养基进行发酵类型的鉴定，分别将6株乳酸菌接入APT培养基，在培养基顶端覆盖1～2 cm厚软琼脂柱，形成PY培养基，于恒温37 ℃培养24 h后观察其变化。若PY培养基中琼脂柱产生位移则为同型菌株；反之则为异型[8]，注意8 h后重复观察。

1.2.2 乳酸菌对甘蔗糖蜜的发酵

将冻藏在-20 ℃的菌株按5%接种量接种于MRS培养基，经37 ℃静止培养，得到一级种子液，再将上述种子液接入MRS液体培养基中活化，获得二级种子培养液。将二级种子培养液按10%接种量分别接种于不同成分的5种发酵培养基（同1.2.1所述），将培养液放置于摇床中培养（120 r/min）；发酵过程中，间隔8 h添加4 mol/L氢氧化钠，维持发酵液的pH保持在5.1～5.4之间。上述步骤均操作于超净台中。

1.3 分析方法

1.3.1 甘蔗糖蜜发酵液中乳酸、乙酸、甲酸的高效液相色谱分析

甘蔗糖蜜发酵液中乳酸等小分子酸采用高效液相色谱仪进行分析，色谱仪为美国Waters Alliance 2695，检测器为Waters 2487紫外检测器，色谱柱为Sino Chrom ODS-BP（150 mm×4.6 mm，10 μm），流动相为5%磷酸氢二铵溶液，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速1 mL/min；样品经0.01 mol/L硫酸酸解稀释后，再经0.22 μm针式过滤器处理后进样[9-11]。

1.3.2 甘蔗糖蜜转化率的分析

采取3, 5-二硝基水杨酸法测定乳酸细菌对葡萄糖的利用率[12-13]。葡萄糖标准溶液配成1 mg/mL的母液，再从中分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL配成不同浓度的标准品，在540 nm波长下测定吸光度，并绘制吸光度-葡萄糖标准曲线。待测样品经0.01 mol/L硫酸酸解后双蒸水稀释，随后处理方式同葡萄糖标准品一致，测定发酵液中的糖分。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的发酵类型

同型发酵菌株对糖分的理论转化率为100%，发酵产物主要是乳酸；异型发酵菌株对糖分的理论转化率为50%，产物有乳酸、乙酸、CO2等[8]。培养24 h及重复观察8 h后，菌株MX4、SN2、SN3均未产生琼脂柱位移，判断为同型发酵类型；其余3株为异型发酵类型，存在葡萄糖浪费的现象。

2.2 甘蔗糖蜜发酵产物的高效液相色谱分析

在高效液相色谱波长为210 nm条件下，测定的Ⅰ号培养基与Ⅴ号培养基发酵液中出现3种有机酸。甲酸、乳酸、乙酸出峰时间分别为3.827，5.959和6.331 min。以峰面积为纵坐标、酸含量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程及相关系数：甲酸，y=563.14x-5 004.5，R2=0.999 9；乳酸，y=429.13x-16 885，R2=0.999 2；乙酸，y=428.88x-5 717.5，R2=0.999 8。标准谱图及样品谱图分别为图1和图2。

高效液相色谱分析表明，发酵液中乳酸、乙酸和甲酸的含量在葡萄糖、甘蔗糖蜜为碳源的发酵培养基（即Ⅰ号与Ⅴ号培养基）中存在共性和特异性（图2～5）。乳酸在2种发酵培养基中的含量均高于乙酸和甲酸，异型发酵菌株MX1和同型发酵菌株SN2在Ⅴ号培养基中乳酸含量最高，分别是145.62和130.48 g/L，但它们在Ⅰ号培养基中含量分别是54.45和46.93 g/L，2种培养基之间又存在显著差异。乙酸在2种发酵培养中的含量出现显著波动，异型发酵ML11、ML7、MX1菌株在2种培养基中都有乙酸形成，Ⅰ号培养基中，含量没有明显差异（1.36，1.57和1.84 g/L），而在Ⅴ号培养基中，差异明显（17.44，1.68和2.44 g/L）；同型发酵菌株MX4与SN3仅在Ⅴ号培养基中检测到乙酸（2.45和1.97 g/L），而SN2菌株在两种培养基中均未检测到乙酸。甲酸在两种发酵培养基中的含量最少，无论同型发酵菌株还是异型发酵菌株在两种培养基中含量均低于1.5 g/L。可见，碳源对乳酸菌发酵液中乳酸、乙酸和甲酸的含量有明显改变。

酸的测定结果表明，Ⅰ号培养基中，SN2是同型发酵菌株中产酸最高的（130.48 g/L的乳酸和0.83 g/L的甲酸），MX1是异型发酵菌株中产酸最高的（145.62 g/L的乳酸、1.84 g/L的乙酸和0.66 g/L的甲酸）。Ⅴ号培养基中，MX4是同型发酵菌株中产酸最高的（107.27 g/L的乳酸、2.45 g/L的乙酸和0.02 g/L的甲酸），ML7是异型发酵菌株中产酸最高的（104.21 g/L的乳酸、1.68 g/L的乙酸和1.07 g/L的甲酸）。试验中，甘蔗糖蜜浓度为15%（150 g/L），SN2可发酵形成130.48 g/L的乳酸；黄靖华等[14]用乳酸菌发酵糖蜜（浓度为20%）可得到106 g/L的乳酸。这进一步说明甘蔗糖蜜可被此次试验的乳酸菌进行高效发酵。

图1 标准品（甲酸、乳酸、乙酸）的高效液相图谱

图2 样品（甲酸、乳酸、乙酸）的高效液相图谱

图3 Ⅰ号培养基与Ⅴ号培养基中乳酸产物量比较

图4 Ⅰ号培养基与Ⅴ号培养基中乙酸产物量比较

图5 Ⅰ号培养基与Ⅴ号培养基中甲酸产物量比较

2.3 乳酸细菌对糖蜜的利用率

DNS法测定原理为3, 5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与还原糖共热后被还原成棕红色3-氨基-5-硝基水杨酸[15]，颜色深浅与含量正相关，所测葡萄糖标准曲线如图6所示。

测定结果表明，6株乳酸菌均对5种培养基中糖分的消耗率在70%以上，表明它们有高发酵力（图7）；Ⅱ号培养基中，菌株对糖分的消耗率在85%左右，说明此时的碳源配比是适应乳酸菌发酵的通用配比；Ⅳ号培养基中，MX1、MX4和SN2对糖分发酵的消耗率在90%左右，说明此时的碳源配比有利于这3株乳酸菌对糖分的高效转化。Ⅴ号培养基中，同为异型发酵菌株的ML11与MX1相比，糖分的消耗率高，单产酸量低，这暗示着ML11消耗的糖蜜被转化成较多的CO2；同型发酵菌株中，SN2糖分消耗率及产酸率双高，这说明SN2可高效的把甘蔗糖蜜转化为乳酸等发酵产物。

综上所述，同型发酵菌株SN2对甘蔗糖蜜有高的转化率，在Ⅰ号与Ⅴ号培养基中均未检测到乙酸的形成；而同型发酵菌株MX4对葡萄糖有高的转化率，在Ⅰ号与Ⅴ号培养基中均检测到乙酸形成；同型发酵菌株SN2和MX4在Ⅳ号培养基中，对糖分的利用率均高于Ⅰ号与Ⅴ号发酵培养基。按照菌株发酵产物有机酸的特征（图3～图5），同型发酵菌株SN2在Ⅳ号发酵培养基中有机酸产物推测以乳酸为主，该菌株的发酵液适合于生产乳酸；同型发酵菌株MX4在Ⅳ号发酵培养基中有机酸的主要产物是乳酸，伴有一定量的乙酸和微量的甲酸，这说明菌株MX4的发酵液适于做为污水处理的C2～C5碳源补给。

图6 葡萄糖溶液的标准曲线

图7 乳酸细菌在不同发酵培养基中对还原性糖的消耗率

3 结论与展望

通过使用工业制糖废料——甘蔗糖蜜为发酵原料，并按照不同糖分配比配置5组培养基，利用6株乳酸菌进行发酵，结果表明蔗糖糖蜜与葡萄糖为1:1的发酵培养基为较适的通用配比，甘蔗糖蜜与葡萄糖为3:1的发酵培养基为特异乳酸菌SN2和MX4发酵的最佳糖分配比，这说明甘蔗糖蜜的添加对有机酸代谢产物的形成有积极影响；异型发酵菌株ML7和MX1分别在以葡萄糖和甘蔗糖蜜为碳源的培养基中优势产酸，达104.21和145.62 g/L；同型发酵菌株中MX4和SN2分别在以葡萄糖和甘蔗糖蜜为碳源的培养基中优势产酸，达107.27和130.48 g/L；按菌株发酵产物的特征推断得知，同型发酵菌株SN2在甘蔗糖蜜与葡萄糖的配比为3:1的发酵培养基中产物主为乳酸，其发酵液更适于生产乳酸；同型发酵菌株MX4在甘蔗糖蜜与葡萄糖的配比为1:3的发酵培养基中产物主为乳酸、乙酸及微量甲酸，其发酵液更适于做污水处理的碳源补给。

试验探究了甘蔗糖蜜的乳酸菌发酵液产物，结果表明菌株SN2的甘蔗糖蜜发酵液具有生产乳酸的广阔前景，菌株MX4的甘蔗糖蜜发酵液可应用于污水处理中的碳源补给，这些结果表明甘蔗糖蜜的乳酸发酵液可增加甘蔗糖蜜的附加值，实现资源的高效循环利用，形成“制糖厂→甘蔗糖蜜收集厂→甘蔗糖蜜的乳酸发酵厂→发酵液浓缩→乳酸盐”或“制糖厂→甘蔗糖蜜收集厂→甘蔗糖蜜的乳酸发酵厂→发酵液添加到废水处理厂→洁净水”等的良好模式，这将为甘蔗发展提供绿色的生态循环模式。