小花清风藤绿茶制备工艺及其抗氧化活性

王小贤，田甜，苏香萍*，邹坤，李建桥，胡建忠

1. 三峡大学生物与制药学院，天然产物研究与利用湖北省重点实验室（宜昌 443002）；2. 水利部水土保持植物开发管理中心（北京 100038）

小花清风藤（Sabia parviflora Wall. Ex Roxb）为常绿木质攀援藤本，长2～4 m。芽鳞卵形，先端长尖，背面有中肋，有缘毛。单叶互生，叶柄长0.5～2 cm，叶片纸质或近薄革质，卵状披针形、狭长圆形或长圆状椭圆形，长5～12 cm，宽1～3 cm，先端渐尖，基部圆形或宽楔形，侧脉每边5～8条。小花清风藤根、茎、枝、叶均可入药，有祛风除湿，消炎止痛的作用[1]。

绿茶主要化学成分为多酚类物质[2]、氨基酸类物质、碳水化合物、维生素、色素、挥发性化合物、矿物质和微量元素等[3]。一直以来，绿茶被用作保健饮料，具有多种药理作用，如抗癌活性[4]、抗糖尿病活性、控制体重、抗氧化活性和抗高血压和心血管[5]等作用。

目前，对于小花清风藤制备成产品的研究还相对较少，主要集中在制备成具有养肝护肝作用的产品，如将小花清风藤与大枣等原料配制后，将其制备成护肝解毒功能饮料等[6]，仍鲜见将小花清风藤为原料用于制备绿茶的技术文献报道。鉴于此，研究将以小花清风藤为原料，优化其绿茶加工工艺条件，包括摊青时间、杀青方式和干燥方式，使得制备的小花清风藤绿茶汤色、气味和各项功能指标符合要求，为小花清风藤绿茶产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小花清风藤鲜叶，于2017年9月12日采自贵州省黔西南布依族苗族自治州兴义市安龙县茶园。1, 1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、愈创木酚、茶多酚、甘氨酸、茚三酮、VC、芦丁、邻苯二酚、不溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、二水氯化亚锡、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、NaNO2、Al(NO3)3、硫酸亚铁，酒石酸钾钠、过氧化氢、尿素、硫酸铵、柠檬酸，均为分析纯。

数显恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司；SP-754型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；TGL-16 G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ 5200 E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小花清风藤绿茶制备方法

摊青：采用室内自然摊放方式，将鲜叶均匀摊放，置于通风阴凉室内，摊放厚度为1.0～1.5 cm，室内温度在20～25 ℃范围，在自然环境条件下鲜叶中含水量为70%左右[7]。

杀青：采取微波杀青的方式[8]。每次投叶量为10 g，厚度为0.5～1.0 cm，杀青时间选取30，60，90，120和300 s 5个时间点进行处理，微波杀青功率选取70，210，350，560和700 W进行处理。杀青后及时取样，采用1.2.2、1.2.3和1.2.4小节中的方法分别测定杀青叶的失水率和PPO、POD活性，以确定最佳的杀青条件。

揉捻：杀青叶冷却后，按照“轻重轻”原则沿同一方向揉捻，一边揉捻一边抖动，揉捻成形度达85%～95%即可。

做形：掌握“轻重轻”的原则。将叶置于手心，一手静止，一手前后平行往同一方向揉搓，每次轻搓时间不超过6 s。当搓揉到叶变硬有刺手感时，停止做形。

干燥：烘箱干燥采用电热鼓风干燥箱进行，将杀青的茶叶放入瓷盘中，厚度约为1.0～1.5 cm，烘箱温度为60 ℃，烘至含水率6%以下的安全范围。

1.2.2 鲜叶失水率的测定[9]

每次投叶杀青前准备称量10 g鲜叶（M，g），杀青后静置5 min，称量（m，g），则：

1.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性[10]

称取洗净鲜叶5 g于研钵中，加入2 g PVPP和100 mL 0.1 mol/L pH 6.5磷酸缓冲液，磨成匀浆，用几层纱布过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60%饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于3 mL pH 6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

取酶液1 mL于离心管中，加入3 mL反应混合液（0.1 mol/L pH 6.5磷酸缓冲液与1%邻苯二酚体积比10:3），在37 ℃恒温水浴中保温10 min，立即加入6 mol/L尿素溶液3 mL。以4 000 r/min离心10 min，取上清液，用10 mm比色皿，在460 nm波长处，1～2 min内测定吸光度（A）。空白对照用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚，其他条件相同。结果计算：以每克样品每分钟内A460增加0.1为1个酶活力单位。

式中：A460为反应终止时以空白为对照在460 nm处的吸光度；m为样品干重；t为反应时间（min）。

1.2.4 过氧化物酶（POD）活性[11]

称取鲜叶0.1 g，加20 mmol/L KH2PO45 mL，于研钵中研磨成匀浆，以10 000 r/min离心10 min，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20 mmol/L KH2PO45 mL提取1次，合并2次上清液。

取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3 mL，KH2PO41 mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3 mL，上述酶液1 mL，立即开启秒表，于分光光度计470 nm波长下测量OD值，每隔30 s读数1次。以每分钟内A470变化0.01为一个酶活性单位。

式中：V1为酶液总体积，mL；V2为测定用酶液体积，mL；M为样品鲜质量，g；t为反应时间，min。

1.2.5 茶多酚含量测定[12]

茶多酚标准曲线的制作：称取茶多酚纯品0.250 0 g，加水溶解定容至250 mL，混匀，即为1 mg/mL茶多酚的标准溶液。分别称取标准溶液0.0，1.0，2.0，3.0和4.0 mL于一组50 mL比色管中，各加水至10 mL，再加酒石酸铁溶液10 mL，用pH 7.5的缓冲液定容至刻度，于540 nm处测定吸光度，绘制出标准曲线。

标准曲线：y=0.163 3x-0.000 7，r2=0.999 7。

样品测定：称取磨碎茶叶试样0.1 g（准确至0.000 1 g），加水30 mL煮沸，冷却，加压过滤，注入100 mL容量瓶中，定容、摇匀、过滤，弃去初滤液约20 mL，剩余的滤液为试液。取试液2 mL于50 mL比色管中，加酒石酸铁10 mL摇匀，用pH 7.5的磷酸盐缓冲液定容，于540 nm处测定吸光度。按照标准曲线计算供试品中茶多酚的含量。

1.2.6 总氨基酸含量测定[13]

氨基酸标准曲线的绘制：准确称取甘氨酸100 mg溶于100 mL水中，然后用水稀释至如下质量浓度：40，80，160，240和320 μg/mL。分别移取以上各浓度溶液1.0 mL置于25 mL容量瓶中，加0.5 mL缓冲液，再加茚三酮显色剂0.5 mL，在沸水浴中加热15 min，冷却后加水定容至25 mL。放置10 min，于570 nm处，以空白试剂做参比溶液，测吸光度。以氨基酸浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制出标准曲线。

标准曲线：y=0.004 3x-0.143 4，r2=0.987 7。

1.2.7 总黄酮含量的测定[14]

芦丁标准曲线的绘制：分别称取芦丁标准品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加入硝酸铝溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加入4% NaOH溶液4.0 mL后加95%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min，在510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制出标准曲线。

标准曲线：y=8.591 8x+0.003 4，r2=0.988 5。

1.2.8 绿茶清除DPPH能力[15]

参照文献[16-17]，分别取不同浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mg/mL）绿茶提取液2 mL于试管中，加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液（无水乙醇配制），混合均匀，室温下暗处静置 30 min后，以2 mL水与2 mL无水乙醇的混合液调零点在波长518 nm处测定其吸光度A1，以2 mL水代替提取液与2 mL DPPH溶液混合反应后测定其吸光度A0。以2 mL提取液与2 mL无水乙醇混合液测定其吸光度A2，以消除提取液本身的影响。以维生素C作为清除DPPH·的阳性对照品。按以公式（4）计算不同浓度绿茶提取液对 DPPH·清除率：

求出绿茶浓度与DPPH·清除率的线性回归方程，然后计算得到绿茶清除DPPH的IC50。

1.2.9 试验数据处理与统计分析

试验数据采用均数±标准差（mean±SD）表示，各单因素试验数据处理采用Origin 9.0软件绘图，采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，每个处理进行3次重复。

2 结果与分析

2.1 不同摊放时间叶含水量的变化和摊放叶品质的影响

采用室内自然摊放方式，将鲜叶均匀摊放，置于通风阴凉室内，摊放厚度为1.0～1.5 cm，室内温度在20～25 ℃范围，设置不同的摊放时间（分别为4，6，8，10 和12 h，中途轻翻1～2次），考察不同摊放时间下鲜叶的失水率，以确定达到摊放适度所需的时间。

从表1可以看出，采用自然摊放方式，8 h可以达到最佳摊放效果。在此条件下，摊放叶达到适中的失水率30.9%，且叶色浅暗绿，叶形略皱缩、柔软，有轻微清香。

2.2 微波杀青时间对绿茶失水率和PPO、POD酶活的影响

杀青时高温能钝化酶的活性，同时会对茶的内含成分造成影响。从图1可以看出，在微波350 W下杀青，鲜叶的失水率随着杀青时间的增加而增加。鲜叶的PPO酶活随着杀青时间的延长而降低，其中60 s下降最明显，从19.86 U降低到4.98 U，然后随着杀青时间的延长酶活下降不明显，在120 s时降低到最小值2.71 U。同时鲜叶的POD酶活也随着杀青时间的延长而降低，但POD酶活下降的速度趋于平稳。综合考虑在微波杀青功率350 W下微波杀青时间对3个指标（失水率、和PPO、POD活性）的影响，其最佳的杀青时间为90 s。

表1 不同摊放时间对在制叶含水量及品质的影响

图1 杀青时间对酶活和失水率影响

2.3 微波杀青功率对绿茶失水率和PPO、POD酶活的影响

从图2可以看出，在杀青时间90 s下，鲜叶的失水率随着杀青功率的增加而增加，在350 W时失水率增加明显达到40.40%，然后随着功率的增加失水率趋于平稳。鲜叶的PPO酶活随着杀青功率的增加而降低，其中350 W下降最明显，从29.58 U降低到2.96 U，然后随着杀青功率的增加酶活下降不明显。同时鲜叶的POD酶活也随着杀青功率的增加而降低，但POD酶活下降的速度趋于平稳。综合考虑在杀青时间90 s下微波杀青功率对其3个指标失水率、和PPO、POD活性的影响，其最佳的杀青功率为350 W。

2.4 微波杀青、蒸青和炒青三种杀青方式对绿茶品质的影响

微波杀青：将鲜叶经捡剔后均匀摊放8 h，350 W微波杀青90 s，然后60 ℃烘箱干燥20 min。炒青工艺：将鲜叶经捡剔后均匀摊放8 h，120 W（60 ℃）电磁炉炒青3 min，60 ℃烘箱干燥20 min。蒸青工艺：在已经产生蒸汽的蒸屉上摊放10 g萎凋叶，平摊厚度1 cm左右，杀青时间5 min，取出后立即摊凉。

由表2可知，微波杀青、蒸青和炒青三种杀青方式制备的绿茶中的以微波杀青绿茶茶多酚含量最高为115.43 mg/g，其次为蒸青95.02 mg/g，最低为炒青47.05 mg/g。三种杀青方式制备的绿茶中以蒸青绿茶总氨基酸含量最高为10.53 mg/g，其次为微波杀青10.18 mg/g，最低为炒青9.60 mg/g。三种杀青方式制备的绿茶中以微波杀青绿茶总黄酮含量最高为71.15 mg/g，其次为蒸青57.03 mg/g，最低为炒青42.69 mg/g。

图2 杀青功率的酶活和失水率的影响

由图3可知，不同杀青方式制备的绿茶样品对DPPH自由基的清除率总体趋势是随浓度的增加而提高，但当质量浓度增加到0.2 mg/mL后，DPPH·清除率随浓度的增大不再明显提高。相同浓度的微波杀青、蒸青和炒青绿茶样品在质量浓度低于0.15 mg/mL时，微波杀青绿茶对DPPH·清除率效果明显高于蒸青和炒青；当质量浓度为0.15 mg/mL时，微波杀青绿茶对DPPH·清除率效果与蒸青几乎相同为45%，高于炒青绿茶的清除率37.8%；当质量浓度高于0.15 mg/mL时，微波杀青绿茶对DPPH·清除率效果高于蒸青和炒青，蒸青和炒青清除率相差不大。

图3 杀青方式对DPPH·清除率影响

由表3可知，三种杀青方式制备的绿茶对DPPH·清除活性IC50值顺序为蒸青＞炒青＞微波杀青，IC50的值越小说明对DPPH·的清除效果越好。说明微波杀青制备绿茶的DPPH·清除活性最强，其IC50值为0.141 mg/mL，但较VC 0.012 mg/mL弱；次之为炒青绿茶的DPPH·清除活性，其IC50值为0.198 mg/mL，其与蒸青绿茶的IC50值为0.196 mg/mL相当。综合考察微波杀青、蒸青和炒青三种杀青方式制备的绿茶的茶多酚、总氨基酸、总黄酮和对DPPH·清除率效果，微波杀青方式制备的绿茶品质较好。

表3 杀青方式绿茶对DPPH·清除率活性的IC50值mg/mL

2.5 不同干燥方式对茶品质的影响

三种干燥方式如下：60 ℃、120 W手工炒制20 min；60 ℃烘箱干燥20 min；先60 ℃、120 W手工炒制10 min，后60 ℃烘箱干燥10 min。

由表4可知，手工炒制、烘箱干燥和手工+烘箱干燥三种干燥方式制备的绿茶中以手工+烘箱绿茶茶多酚含量最高为124.62 mg/g，其次为烘箱干燥115.43 mg/g，最低为手工炒制104.20 mg/g。三种干燥方式制备的绿茶中以手工+烘箱绿茶总氨基酸含量最高为12.11 mg/g，其次为手工炒制11.34 mg/g，最低为烘箱干燥10.18。三种杀青方式制备的绿茶中以烘箱干燥绿茶总黄酮含量最高为71.15 mg/g，其次为手工+烘箱58.89 mg/g，与手工炒制58.87 mg/g相当。

表4 干燥方式对绿茶各成分含量的影响 mg/g

由图4可知，不同干燥方式制备的绿茶样品对DPPH自由基的清除率总体趋势是随浓度的增加而提高，其中烘箱干燥绿茶样品质量浓度增加到0.25 mg/mL时，其对DPPH·清除率为69.44%，然后随浓度的增大不再明显提高，且均高于相同浓度的手工炒制和手工+烘箱绿茶样品的清除率，其中手工+烘箱绿茶样品的清除率相对较低。

由表5可知，三种干燥方式制备的绿茶对DPPH·清除活性IC50值顺序为：烘箱干燥＞手工炒制＞手工+烘箱。说明烘箱干燥制备绿茶的DPPH·清除活性最强，其IC50值为0.140 5 mg/mL，但较VC 0.012 03 mg/mL弱；次之为手工炒制绿茶的DPPH·清除活性，其IC50值为0.215 6 mg/mL，其与手工+烘箱绿茶的IC50值为0.226 2 mg/mL相当。综合考察手工炒制、烘箱干燥和手工+烘箱干燥三种干燥方式制备的绿茶的茶多酚、总氨基酸、总黄酮和对DPPH·清除率效果，烘箱干燥方式制备的绿茶品质较好。

图4 不同干燥方式DPPH·清除率

表5 干燥方式绿茶对DPPH·清除率活性的IC50值

3 结论与讨论

参考绿茶加工工艺制作小花清风藤绿茶，对各工序关键技术进行对比试验，获得最佳小花清风藤绿茶备工艺为：采取室内自然摊青方式摊放8 h，此时叶形略皱缩、柔软，有轻微清香；采用微波杀青方式，其最佳功率为350 W，最佳杀青时间为90 s；采用烘箱干燥方式，其最佳干燥方式为60 ℃干燥20 min。此工艺条件下制备的绿茶茶多酚含量为115.43 mg/g、总氨基酸含量为10.18 mg/g、总黄酮含量为71.15 mg/g，此总黄酮含量远高于原江峰等[18]制备连翘叶绿茶的26.48 mg/g。当质量浓度在0.35 mg/mL时，对DPPH自由基有较高的清除率，为74.11%，其IC50值为0.140 5 mg/mL。说明小花清风藤绿茶有一定的清除自由基的作用，因此充分利用这一绿色资源开发各种保健品、食品添加剂、食品具有较好的市场。