miR-21在黄芪甲苷保护ox-LDL诱导的内皮细胞炎症损伤过程中的作用

常方圆 冯泽瑞 许迎春 张秋霞

氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是一种氧自由基携带者，也是公认的造成动脉粥样硬化的独立危险因子，可通过调控内皮细胞通透性、诱导细胞凋亡和炎症反应等使内皮屏障功能降低，引起内皮细胞损伤[1-3]；而血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化公认的始动环节。因此，如何保护血管内皮免受包括炎症在内的细胞损伤，一直是动脉粥样硬化研究的热点。黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎和抗纤维化等作用[4]。近年来，黄芪甲苷在抗动脉粥样硬化和在ox-LDL所导致的血管内皮细胞炎症损伤中的保护作用已得到证实[5-6]，但其具体的作用机制并不完全明确。有研究指出，ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞中微小RNA（microRNA，miR）-21表达降低[7]，而黄芪甲苷被证实可通过上调miR-21表达促进心血管疾病的血管生成[8]。同时，采用生物信息学软件预测发现，miR-21与炎症相关因子TLR4 3′UTR区域存在着互补的核苷酸序列。猜测miR-21可能通过靶向调控 Toll样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）TLR4表达在黄芪甲苷保护ox-LDL诱导的内皮细胞炎症损伤过程中发挥着重要作用。因此，本研究通过构建ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）损伤模型，观察黄芪甲苷减轻ox-LDL诱导诱导的HUVEC炎症损伤是否与miR-21有关。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

黄芪甲苷购于上海融禾医药科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉双抗和胰蛋白酶购于美国Hyclone公司；氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）购于广州突源生物科技有限公司。噻唑蓝（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂购于美国Sigma公司；脂质体2000购于美国Invitrogen公司。miR-21模拟物、miR-21抑制剂及其相应对照购于广州锐博生物公司。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购于美国Millipore公司，抗人Toll样受体4（toll-like receptor-4，TLR4）单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，鼠抗人β肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体购于北京康为世纪生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠IgG抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，pmirGLO载体购于深圳市伟通生物科技有限公司，Trizol试剂和二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联接免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）ELISA试剂盒购于上海双赢生物科技有限公司，荧光素酶检测试剂盒购于美国Promega公司。

1.2 细胞培养、分组及转染

采用含10%胎牛血清和100 U/mL青链霉双抗的DMEM高糖培养基于37℃和5%CO2的细胞培养箱中常规培养来自于上海中乔新舟科技公司的HUVEC。将对数生长期的HUVEC随机分为对照组（未干预）、模型组（100 μmol/L ox-LDL作用24 h）、治疗-低剂量（L）组、治疗-中剂量（M）组和治疗-高剂量（H）组，其中治疗-L、M和H组细胞先加入100 μmol/L ox-LDL作用24 h后，再分别以10、20和40 mg/L的黄芪甲苷作用2 h。后期将对数生长期的HUVEC分为模型组、miR-NC组、miR-21组、anti-miR-NC组和anti-miR-21组，采用脂质体法将miR-21模拟物阴性对照miR-NC、miR-21模拟物、miR-21抑制剂阴性对照anti-miR-NC和miR-21抑制剂参照脂质体2000说明书步骤分别转染至miR-NC组、miR-21组、anti-miR-NC组和anti-miR-21组细胞中，转染48 h后以100 μmol/L ox-LDL作用24 h，观察miR-21过表达或低表达对ox-LDL诱导的HUVEC炎症损伤的影响。另外，设置模型组、治疗组（ox-LDL干预后给予40 mg/L的黄芪甲苷作用）和治疗+anti-miR-21组（转染miR-21抑制剂后，分别以ox-LDL和40 mg/L的黄芪甲苷干预），观察miR-21低表达对黄芪甲苷作用下HUVEC炎症因子的影响。

1.3 MTT法检测HUVEC存活率

向黄芪甲苷和ox-LDL处理结束后的各组细胞以及不含细胞只有培养基的空白孔中加入5 g/L MTT溶液10 μL，细胞培养箱中孵育4 h后，加入二甲基亚枫150 μL溶解MTT晶体。采用酶标仪在490 nm波长处测定各组细胞光密度（optical density，OD）值，计算各组细胞的存活率。计算公式：存活率（%）=（实验孔OD-空白孔OD）/（对照孔OD-空白孔OD）×100%。

1.4 ELISA法检测HUVEC上清液中炎症因子TNF-α、IL-6和NF-κB含量

将对数生长期的HUVEC以适当密度接种至10 cm的培养皿中，按照对照组、模型组、治疗-L组、治疗-M组、治疗-H组的分组处理结束后，弃培养液，经磷酸缓冲液洗涤后，转移至离心管中，以1 000 r/min离心5 min，收集上清液，参照ELISA试剂盒说明书步骤分别检测TNF-α、IL-6和NF-κB含量。

1.5 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）检测 HUVEC中miR-21和TLR4 mRNA的表达

使用Trizol试剂抽提各组HUVEC总RNA，并采用超微量紫外分光光度计检测总RNA的浓度。按照逆转录试剂盒说明书步骤将RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板，根据上海生工生物工程有限公司合成的miR-21引物（上游：5′-GCGCGCTAGCTTATCAAGCTGATG-3′，下游：5′-GTGCAGGCTCCGAGGT-3′）、U6 引物（上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 ：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）、β-actin引物（上游：5′-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3′，下游：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′）和TLR4引物（上游 5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′，下游5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′）进行 PCR 扩增，PCR 反应条件如下：94℃ 10 min，94℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s循环35次。以U6和β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算 HUVEC 中 miR-21 和 TLR4 mRNA的表达。

1.6 Western blot检测HUVEC中TLR4蛋白的表达

胰蛋白酶消化收集各组HUVEC，加入细胞裂解液提取各组细胞总蛋白。采用BCA法对总蛋白定量后，以等体积上样换液与待测样品蛋白混匀，沸水浴变性5 min。取变性蛋白以每孔80 μg上样至十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶孔中行电泳分离。电泳结束后，电转至PVDF膜。经5%脱脂奶粉室温摇床封闭1.5 h后，分别以一抗（1∶500）4℃孵育过夜，二抗（1∶2 000）室温孵育1 h。电化学（electrochem-iluminescence，ECL）法显影后，采用凝胶成像分析Quantity one软件进行灰度分析。

1.7 双荧光素酶报告基因实验检测miR-21和TLR4的靶向关系

采用TargetScan生物学信息学软件预测发现，miR-21与TLR4 3′UTR存在互补的核苷酸序列。为了证实miR-21与TLR4是否存在靶向关系，由百奥迈科生物技术有限公司构建野生型（WT-TLR4）和突变型（MUT-TLR4）的 TLR4的3′-UTR荧光素酶报告载体，参照脂质体2000说明书步骤行miR-NC+WT-TLR4、miR-21（miR-21模拟物）+WT-TLR4、miR-NC+MUT-TLR4、miR-21+MUT-TLR4转染，于细胞培养箱中常规培养48 h后收集细胞，根据荧光素酶检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞的荧光素酶的活性。

1.8 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料以（）形式表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对HUVEC内炎症因子分泌的影响

与对照组相比，模型组、治疗-L组、治疗-M组和治疗-H组细胞的存活率显著降低，而炎症因子TNF-α、IL-6和NF-κB含量显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗-L组、治疗-M组和治疗-H组细胞存活率显著升高，而TNF-α、IL-6和NF-κB含量显著降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性，见表1。

表1 黄芪甲苷对HUVEC内炎症因子分泌的影响Table1 Effect of astragaloside IV on secretion of inflammatory factors in HUVEC

2.2 黄芪甲苷对HUVEC内miR-21和TLR4表达的影响

与对照组相比，模型组、治疗-L组、治疗-M组和治疗-H组细胞内miR-21表达水平均显著降低，而TLR4 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗-L组、治疗-M组和治疗-H组细胞内miR-21表达水平表达水平均依次显著升高，而TLR4 mRNA和蛋白表达水平均依次降低（P＜0.05）。见表2和图1。

2.3 miR-21与TLR4靶向关系的验证

生物信息学软件TargetScan预测发现，TLR4 3′UTR存在能够与miR-21互补的结合位点，结果见表3。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与miR-NC+TLR4-WT组相比，miR-21过表达miR-21+TLR4-WT组细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而 miR-NC+TLR4-MUT 组和 miR-21+TLR4-MUT组间的荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表2 黄芪甲苷对HUVEC内miR-21和TLR4表达的影响Table2 Effect of astragaloside IV on the expression of miR-21 and TLR4 in HUVEC

2.4 miR-21对HUVEC内炎症因子分泌和TLR4表达的影响

与模型组相比，miR-NC组和anti-miR-NC组细胞的存活率、细胞内炎症因子TNF-α、IL-6、NF-κB含量和TLR4 mRNA的表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；但是，与模型组相比，miR-21组细胞存活率升高、细胞内TNF-α、IL-6和NF-κB含量以及TLR4 mRNA、蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05），而anti-miR-21组细胞存活率升高且细胞内 TNF-α、IL-6和 NF-κB 含量以及 TLR4 mRNA、蛋白的表达水平均明显升高（P＜0.05）。见表5和图2。

图1 Western blot检测黄芪甲苷对TLR4蛋白表达的影响Figure1 The effect of astragaloside IV on the expression of TLR4 protein was detected by Western blot

2.5 下调miR-21表达对HUVEC炎症因子分泌的影响

与模型组相比，治疗组、治疗+anti-miR-NC组和治疗+anti-miR-21组细胞存活率显著升高，而细胞内TNF-α、IL-6、NF-κB 含量和TLR4 mRNA、蛋白的表达均显著降低（P＜0.05）；与治疗组相比，治疗+antimiR-21组细胞存活率显著降低，细胞内TNF-α、IL-6、NF-κB 含量和TLR4 mRNA、蛋白的表达均显著升高（P＜0.05）；而治疗+anti-miR-NC组与治疗组相比无显著性差异（P＞0.05）。结果见表6和图3。

表3 TLR4 3′UTR与miR-21的结合位点Table3 Binding sites of TLR4 3′UTR and miR-21

表4 各组HUVEC荧光素酶活性的比较Table4 Comparison of luciferase activities in HUVEC

3 讨论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性血管疾病，炎症反应存在与动脉粥样硬化的各个阶段。越来越多的证据显示，ox-LDL通过调控NF-κB/TNF-α信号通路等诱导的炎症反应是导致血管内皮损伤的重要机制[9-11]。本研究以ox-LDL刺激HUVEC后检测得到促炎相关因子TNF-α、IL-6和NF-κB含量均显著升高，且细胞存活率降低，这表明ox-LDL成功诱导HUVEC出现炎症损伤。

黄芪甲苷又称黄芪皂苷IV，是黄芪皂苷中的主要成分，具有抗氧、抗炎症和免疫调节等药理作用。Qin等[12]指出，黄芪甲苷可通过调控SDF-1/CXCR4生物轴下调甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和上调高密度脂蛋白胆固醇水平发挥抗动脉粥样硬化的作用。马海涛等[13]发现，黄芪甲苷可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路逆转过氧化氢对HUVEC增殖和凋亡的调控改善氧化应激诱导的HUVEC损伤。You等[14]研究证实，黄芪甲苷对高葡萄糖诱导的HUVEC损伤具有显著的保护作用，其作用机制与抑制JNK信号通路促进细胞增殖、减少凋亡并降低炎症因子TNF-α、IL-1β的表达有关。上述研究表明，黄芪甲苷在改善动脉粥样硬化和改善血管内皮损伤方面的具有较好

的作用。本研究以10、20和40 mg/L的黄芪甲苷作用HUVEC后发现，ox-LDL诱导的HUVEC炎症损伤得到显著改善。该结果与魏冰等[6]得到的黄芪甲苷具有保护ox-LDL所致血管内皮细胞炎症损伤的结果相似。结果表明，黄芪甲苷可改善ox-LDL诱导的HUVEC炎症损伤。

表5 miR-21对HUVEC内炎症因子分泌和TLR4表达的影响Table5 Effect of miR-21 on inflammatory factor secretion and TLR4 expression in HUVEC

表6 下调miR-21表达对黄芪甲苷刺激下HUVEC炎症因子分泌的影响Table6 Effect of down-regulation of miR-21 expression on secretion of inflammatory cytokines in HUVEC stimulated by astragaloside

图2 Western blot检测miR-21对TLR4蛋白表达的影响Figure2 The effect of miR-21 on the expression of TLR4 protein was detected by Western blot

图3 Western blot检测下调miR-21对黄芪甲苷刺激下TLR4蛋白表达的影响Figure3 Down-regulation of miR-21 on the expression of TLR4 protein stimulated was detected by Western blot

TLR4是Toll样受体家族成员，可通过调控下游NF-κB及炎性因子在炎症与免疫反应中发挥着重要作用[15-17]。Tian 等[18]研究以及蔡谦谦等[19]研究均证实TLR4在ox-LDL诱导HUVEC炎症损伤过程中发挥着重要的促进作用。Tang等[7]研究指出，ox-LDL可降低miR-21表达，诱导细胞凋亡，导致人主动脉内皮细胞损伤；而miR-21过表达可消除ox-LDL诱导的内皮细胞损伤。Ma等[20]发现，在脂多糖诱导的HUVEC炎症反应中，miR-21靶向抑制TLR4表达。这些研究显示miR-21和TLR4在主动脉内皮细胞炎症损伤过程中发挥着重要作用。本研究通过TargetScan软件预测和双荧光素酶报告基因实验证实TLR4是miR-21的潜在靶基因。为了进一步探讨黄芪甲苷改善ox-LDL诱导的HUVEC炎症损伤的分子机制，本研究进一步检测发现，黄芪甲苷可呈浓度依赖性降低ox-LDL诱导的TLR4表达，并升高miR-21表达。这与Yu等[8]报道的黄芪甲苷可通过上调miR-21表达促进心血管疾病的血管生成的机制部分一致。另外，本研究下调miR-21表达可逆转黄芪甲苷对HUVEC炎症损伤的保护作用。结果提示，上调miR-21靶向抑制TLR4表达是黄芪甲苷减轻ox-LDL诱导的HUVEC炎症损伤的重要机制。

综上所述，黄芪甲苷可通过调控miR-21靶向抑制TLR4表达减轻ox-LDL诱导的HUVEC炎症损伤。本研究仅从细胞水平揭示了黄芪甲苷改善HUVEC炎症损伤的部分机制，后期工作将从动物水平上进行验证，以期为黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的治疗提供新的实验依据。