东莞市2017-2018年儿童下呼吸道感染病例监测结果

孙志豪 张荣华 钟超珍

呼吸系统感染是儿科的常见疾病，是发展中国家乃至发达国家低年龄段人口的重要死因之一，越来越受到公众的关注[1-3]。在我国珠三角地区如广州、深圳等城市的流行病学研究中显示，社区获得性肺炎（community acquire pneumonia，CAP）往往伴随多种呼吸道病原体感染[4-5]。东莞市位于珠江三角洲地区，地理上属于亚热带季风气候，雨热同期，受本地独特气候特点的影响，呼吸系统疾病的流行有其独特的规律。儿童下呼吸道感染的病原体的构成复杂，临床症状缺乏特异性，传统的病原学诊断常通过病原体分离培养实现，该方法缺耗费时间长，且鉴定数量有限，难以满足临床诊断需求[6]。而液相芯片技术的出现，恰好弥补了这些缺陷，有助于快速确诊、控制病情。液相芯片，也称为微球悬浮芯片，是基于美国Luminex公司开发的新型生物芯片技术平台，具有操作简单，杂交动力学快，应用灵活等优点[7-10]。本研究采用基于液相芯片平台的核酸检测技术，对东莞市妇幼保健院住院患儿下呼吸道感染标本进行13种常见呼吸道病原体的核酸检测，并对结果进行分析，尝试在多重病原体、较大样本量的维度上研究儿童呼吸系统感染的流行规律，为儿童呼吸系统感染性病例的预防和控制提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究的研究对象选取自2017年11月至2018年10月在东莞市妇幼保健院因下呼吸道感染住院的2 850例患儿。在对患儿进行呼吸道标本采集前均征得患儿家长/监护人知情同意并通过患儿所在医院伦理委员会批准。诊断标准依据《儿童社区获得性肺炎管理指南（2013修订）》[11-12]，住院患儿入组符合下呼吸道感染标准：出现咳嗽、痰粘稠，肺部出现湿罗音，并有下列3种情况之一：①发热；②白细胞总数和（或）嗜中性粒细胞比例增高；③X线显示肺部有炎性浸润性病变。排除标准：非感染性原因如肺栓塞、心力衰竭、肺水肿、肺癌等所致的下呼吸道的胸片改变。在2 850例患儿中，男性1 781例（62.49%），女性 1 069例（37.51%）；0～≤6月龄患儿 1 051例（36.90%），＞6～≤12月龄患儿 554例（19.40%），＞1～≤3周岁患儿956例（33.50%），＞3～≤7周岁患儿228例（8.00%），＞7周岁以上患儿61例（2.10%），中位数年龄为10个月。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

在患儿入院当天采集咽拭子置于2 mL样品保存液中，4℃保存并在24 h内送至实验室进行检测，标本运输过程均保持4℃。

1.2.2 试剂和仪器

试剂：核酸提取试剂盒采购自广州美基生物科技有限公司，PCR试剂采购自中山大学达安基因股份有限公司，液相芯片检测试剂耗材采购自美国Luminex公司。

仪器：PCR仪采购自安杰思医学科技有限公司，型号为AGT9601。液相芯片检测仪采购自美国Luminex公司，型号为Magpix50。

1.2.3 引物与探针

1.2.3.1 多重PCR引物设计 由于流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒是RNA病毒，因此这6种RNA病毒的多重反转录PCR设计在一管中反应，这6种病毒，以及用于内参的人的GAPDH基因对应的PCR引物序列见表1。而博卡病毒、腺病毒、肺炎支原体、卡塔布兰汉菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、百日咳菌则是基于DNA水平检测，因此无需做反转录，只需要基于PCR扩增即可，这7种基于DNA检测的病原体的多重PCR引物引物序列见表2。

所有的反向引物R引物的5′端均用生物素进行标记。

1.2.3.2 探针设计 针对8种病毒、5种细菌、1种支原体和1个人的内参基因一共设计了15条探针，探针序列如表3。

所有探针的5′端均用连续18个碳原子加上氨基修饰。

表1 检测RNA病毒的多重PCR引物序列Table1 Detection of RNA virus by multiplex PCR primer sequence

表2 基于DNA检测的病原体的多重PCR引物序列Table2 Multiplex PCR primer sequences of pathogens based on DNA detection

表3 探针序列Table3 Probe sequence

1.2.4 核酸提取及扩增

待检样本送至实验室后使用核酸提取试剂对样本进行DNA和RNA的提取。完成核酸提取后，取出-20℃保存的13项呼吸道病原体核酸检测试剂盒（RNA/DNA）扩增试剂，解冻、分装加入PCR八联管。将待检核酸与扩增试剂混合后进行PCR扩增。按照PCR扩增试剂盒的操作说明书，根据病原体核酸种类不同，使用不同的扩增程序进行扩增，并选择GAPDH作为内对照进行质控。

检测DNA的病原体为：人博卡病毒（human Bocavirus，hBoV）、腺病毒（adenovirus，AdV）、流感嗜血杆菌（haemophilus influenza，Hi）、肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，MP）、卡他莫拉菌（morella catarrhalis，MC）、肺炎链球菌（streptococcus pneumonia，SP）和百日咳杆菌（bordetella pertussis.BP）；检测RNA的病原体为：呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、流感病毒A型（Influenza A virus，FluA）、流感病毒B型（Influenza B virus，FluB）、人偏肺病毒（human partial pulmonary virus，hMPV）、副流感病毒（parainfluenza virus，PIV）和鼻病毒（human rhinovirus，HRV）。

设置如下程序进行PCR扩增：①检测DNA病原的扩增程序为：37℃10 min，反应1个循环；95℃10 min，反应 1 个循环；95℃ 30 s；52℃ 1 min；65℃1 min；95℃ 30 s，反应 30 个循环；95℃ 30 s；65℃45 s；72℃ 45 s；95℃ 30 s，反应 25 个循环；72℃ 5 min，反应1个循环；12℃保持至反应管从仪器上移走。②检测RNA病原的扩增体系为：50℃30 min，反应1个循环；94℃ 2 min，反应1个循环；94℃ 30 s；52℃ 45 s；72℃ 30 s；94℃ 30 s，反应 30 个循环；94℃ 30 s；65℃ 30 s；72℃ 30 s；94℃ 30 s，反应 25个循环；72℃5 min，反应1个循环；12℃保持至反应管从仪器上移走。扩增结束后，取出并检查样本标记是否依旧清晰，管内试剂是否挥发，已扩增样本尽快进行杂交检测，如需保存需放置4℃冰箱。

1.2.5 核酸杂交

开启Luminex Magpix液相芯片检测平台，进行仪器和软件设置，建立检测程序；将扩增产物分别加入核酸杂交试剂中，在PCR仪上进行杂交显色反应；显色结束后将样品放入Magpix96孔板加热模块中，运行已保存的待检测批次，进行检测，得到结果。

1.3 统计学分析

数据统计通过SPSS 22.0软件完成。计数资料采用例数和百分比表示，组间采用t检验、χ2检验或Fisher确切概率法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原学检测结果

在2 850例患儿的标本中检测出病原体阳性的例数为1 720例（60.35%），检出2种及2种以上病原体阳性的例数为533例（18.70%）；在1 720例病原学阳性患儿中，检出1种病原体阳性例数为1 187例（41.65%），检出2种病原体阳性例数为440例（15.44%），检出3种病原体阳性例数为85例（2.98%），检出4种病原体阳性例数为8例（0.28%）。在13种病原体中，检出率最高的前3种分别是RSV 661例（23.19%），SP 629例（22.07%）和Hi 282例（9.89%）；而混合感染率排名前5的病原体分别是 MC（98/119，82.35%）、HRV（21/34，61.76%），Hi（171/282，60.64%），hMPV（44/75，58.67%）和SP（357/629，56.76%）。具体检测情况详见表4至表6。

表4 2 850例患儿下吸呼吸道感染标本病原体检测结果Table4 Detection of pathogens in 2 850 children with lower respiratory tract infections

表5 2 850例患儿下吸呼吸道感染标本病原体检测结果Table5 Detection of pathogens in 2 850 children with lower respiratory tract infections

表6 2 850例患儿下吸呼吸道感染标本病原体检测结果Table6 Detection of pathogens in 2 850 children with lower respiratory tract infections

2.2 不同年龄组的病原体检出情况

通过比较各年龄别组间（0～≤6月龄组、＞6～≤12月龄组、＞1～≤3周岁组、＞3～≤7周岁组和＞7周岁以上组）的检出率发现，BP、SP、Hi、MP、RSV、AdV、hBoV、HRV和PIV的检出率在组间存在差异。其中低年龄段患儿中最常见的呼吸道病原体是RSV，在3周岁以下的3个年龄组检出率均在20%以上，而3周岁以上患儿中检出率不足2%；SP在0～≤6月龄组仅检出72例（6.85%），随着年龄的增长呈现上升的趋势；MP的检出率也随着年龄的增长逐渐上升；Hi在中间的3个年龄组（＞6～≤12月龄组、＞1～≤3周岁组和＞3～≤7周岁组）检出率均超过10%，而其他2组的检出率较低。13种呼吸道病原体在各年龄组中的检出率详见表7。

表7 不同年龄组下呼吸道感染患儿的病原体检测结果Table7 Pathogen detection results of children with lower respiratory tract infection in different age groups

2.3 各病原体检出率的季节变化

SP的检出率在4月份开始升高，5-10月份间均维持在较高水平（＞20%）；RSV检出率在3月份有1个次高峰，4-6月份有所下降，而后在7月份开始上升并在9月份达到最高峰，并在达到高峰之后迅速下降；Hi的检出率亦呈现明显的季节性，在2月份开始逐渐上升并在5月份达到高峰，之后缓慢下降在10月份之后维持一个较低的水平；MC和MP的检出高峰期均是10-11月份；BP、HRV、hBoV、PIV、FluA、FluB、hMPV和AdV全年各月的检出率均低于10%，其中PIV的检出高峰期是4-6月份，hMPV的检出高峰期是4-5月份。总的来说儿童下呼吸道感染病原体春季检出率春季较其它季节低，具体情况详见图1。

3 讨论

下呼吸道感染是儿童时期的常见病，世界范围内每年5岁以下儿童发生肺炎约1.6亿，中国约0.21亿[11-13]。据世界卫生组织统计，在5岁以下儿童死亡原因中，下呼吸道感染占第二位[11-13]。液相芯片技术是近年来发展迅速的一种高通量、高灵敏度、高灵活性的检测平台，广泛运用于临床诊断的各个领域，包括激素水平测定、核酸检测和免疫学分析等[5-10]。本研究的检测均是基于Luminex Magpix液相芯片平台，在提高检测通量的同时也确保了检测结果的稳定性和可重复性。

本研究的监测时间历时1年，在2 850例社区活动性肺炎患儿临床标本中发现了1 720份（60.35%）病原学阳性标本，其中呼吸道合胞病毒（23.19%）、肺炎链球菌（22.07%）和流感嗜血杆菌（9.89%）是这1年间东莞市儿童社区活动性肺炎病例中检出率最高的3种病原体。呼吸道合胞病毒的检出率在13种病原体中最高，这提示临床医师在临床上不应忽视病毒性肺炎的存在，在进行诊断的时候除了参考常规的体格检查、血常规和X线检查之外，应更加重视病原学实验室检测的结果，科学合理地使用抗生素，避免对单一的病毒性肺炎病例使用抗生素[3]。混合感染率最高的前5位病原体在严格意义上讲均是条件致病微生物（卡他莫拉菌、鼻病毒，流感嗜血杆菌，人偏肺病毒和肺炎链球菌），通常寄生于正常人体呼吸道粘膜中，在机体免疫力下降或原发感染出现之后引起继发性感染，在临床上检出此类病原体的时候应

注意有无其他病原体的合并感染，避免漏诊了原发感染病原体而延误病情[2，7，14-18]。

图1 2 850例患儿标本中13种呼吸道病原体检出率的季节分布特点Figure1 The seasonal distribution of 13 respiratory pathogens in 2 850 children

在对各病原体的检出率就行年龄组间比较之后发现有9种病原体的组间检出率存在差异，其中百日咳杆菌、副流感病毒和呼吸道合胞病毒随着年龄组的增长，检出率逐步下降，呈现比较明显的下降趋势。这一结果与国内过往其他研究的结果[19-22]类似，均是从低年龄组向高年龄组逐渐下降。这可能与低年龄组婴儿的自身免疫力较低有关。例如，目前的免疫规划要求新生婴儿应在6月内完成百白破疫苗的接种，而这段时间恰好是新生儿对百日咳杆菌抵抗力最低的时段，离开了母体的保护，主动免疫屏障尚未形成，这都可以解释低年龄组相对较高的百日咳杆菌检出率。而肺炎链球菌、肺炎支原体的检出率与上述3种病原体恰好相反，随着年龄的增长，检出率呈现逐渐上升的趋势。这一趋势与国内其他同类研究的结果[20-23]类似，这可能与机体呼吸道正常菌群的建立过程有关。婴儿期的呼吸道生态位特异性细菌群落以葡萄球菌属为优势种群，随着年龄的增长葡萄球菌属逐渐被嗜血杆菌属和链球菌属所替代，这也许可以解释肺炎链球菌在不同年龄组之间的检出率差异。但肺炎支原体检出率的组间差异仍然需要进一步的研究。

13种病原体中检出率季节性变化最明显的是呼吸道合胞病毒，呈现非常明显的双峰曲线，2个检出率高峰分别在3月份和9月份，造成这个月间差异的原因可能是与东莞本地典型的亚热带季风气候相关，3月份阴冷潮湿，9月份高温多雨，这种高湿度的环境可能对呼吸道合胞病毒的定植入侵有一定的帮助。此外，副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒和流感嗜血杆菌检出率较高的月份是在4-6月份，而百日咳杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体和卡他莫拉菌检出率较高的月份是在10-12月份，这一结果提示在日常的监测工作中可以根据不同的时间段有的放矢地关注特定的病原体，提高临床诊断过程的效率。

与传统的病原学分离培养及核酸分离培养检测技术相比，基于液相芯片法的流式PCR技术检测效率更高，通量更大，如果能够大规模运用于社区获得性肺炎监测项目，可大大减少监测哨点医院的工作量。但是该检测技术也存在短板，仅仅是对病原体的核酸进行检测，结果的特异性不如传统的病原学分离培养方法[8-10]。这2种检测技术互有优劣，建议在实际监测工作中串联使用，用液相芯片法进行病原学初筛，然后对阳性标本进行病原学分离培养，可有效提高监测系统的效率，更好地指导临床工作。