直肠癌患者外周血中Galectin-3 mRNA、MUC1 mRNA的表达及临床意义

赵梅 张志宏 郭忠燕 陈营

直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌。目前我国直肠癌的发病率和死亡率逐年上升，且呈年轻化趋势。手术治疗和放化疗是直肠癌治疗的主要方法，但其临床效果欠佳，且治疗后5年生存率低于50%[1-2]。直肠癌的临床症状和体征较少，早期诊断和治疗困难，导致多数直肠癌患者就诊时已是中晚期，失去最佳治疗时机[3]。目前临床上多根据直肠癌TNM分期进行预后判断，然而实践证实，相同分期患者预后不尽相同，因此寻找有效的直肠癌预后评估指标具有重要意义。国内外研究发现，Galectin-3、MUC1与肺癌、卵巢癌、肝癌等恶性肿瘤的发生和发展有关，但两者与直肠癌关系的报道较少[4-5]。本研究对直肠癌患者血清中Galectin-3mRNA、MUC1mRNA的表达进行检测，分析不同临床特征患者血清Galectin-3mRNA、MUC1mRNA的表达差异，并结合5年随访资料探讨其表达与直肠癌患者预后的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2011年1月至2014年1月本院的123例直肠疾病患者的临床资料，其中直肠癌患者92例（直肠癌组），男51例，女41例；年龄28～81岁，平均（58.7±11.3）岁；TNM 分期Ⅰ期 12例，Ⅱ期 23例，Ⅲ期37例，Ⅳ期20例；高分化11例，中分化47例，低分化34例；淋巴结转移45例。纳入标准：（1）入选患者均经肠镜病理学活检确诊；（2）新发现肿瘤患者，尚未接受任何手术、放疗、化疗等抗肿瘤治疗；（3）积极配合治疗，依从性好。排除标准：（1）既往肿瘤性疾病患者；（2）心肝肾等脏器功能异常者；（3）合并感染、免疫系统疾病患者；（4）已接受放化疗或其他干预治疗者；（5）中途转院及随访失联者。选取同期直肠腺瘤患者31例（直肠腺瘤组），男17例，女14例；年龄31～80岁，平均（59.1±12.7）岁。另选取37例健康志愿者为健康对照组，男20例，女17例；年龄29～81岁，平均（60.7±11.8）岁。各组性别、年龄等资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会审批，研究对象均知情同意。

1.2 标本采集

取3组受试人员外周血4 mL置于洁净EDTA抗凝管中，3 000 r/min离心10 min后弃去上层血浆，再加入红细胞裂解液静置15 min，3 000 r/min离心10 min弃上清，保留沉淀检测Galectin-3mRNA及MUC1mRNA。本研究所有操作均由专人严格按照操作说明书进行。

1.3 检测方法

1.3.1 仪器与试剂

TRIzol试剂（Invitrogen公司），miScript SYBR Green PCR试剂盒（Promega公司），逆转录试剂盒（上海生工生物工程公司），Taq酶（上海生工生物工程公司），低速离心机（Beckman公司），PCR仪（PE公司），电泳及成像系统（UVP公司）。引物根据GenBank中Galectin-3和MUC1基因序列，由上海生工生物工程公司合成，见表1。

1.3.2 总RNA提取

采用TRIzol进行总RNA提取，在260 nm和280 nm下检测RNA溶液吸光值，选择纯度较高样品进行后续试验。

1.3.3 逆转录和RT-PCR反应

应用逆转录试剂盒合成cDNA，反应体系共20 μL，产物置于-20℃保存备用。应用miScript SYBR Green PCR Kit三步法进行RT-PCR，体系共20 μL，包括 cDNA 5 μL，每种引物 0.5 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 4 μL。扩增条件：95℃预变性 1 min；95℃变性 10 s，62℃退火25 s，70℃延伸10 min，循环45次。结束后采用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。将标准品与样品同时进行RT-PCR检测，绘制标准曲线，计算样本中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA含量，根据本院既往研究结果以mRNA＞103拷贝/mL为阳性。所有标本均重复实验3次，以β-actin作为内参，阴性对照不加模板。

表1 引物序列Table1 Oligonucleotide sequences of primers

1.4 治疗方法

直肠癌患者接受直肠癌根治术治疗，术后3周内接受mFOLOFOX6方案药物化疗：奥沙利铂85 mg/m2，亚叶酸钙200 mg/m2，2 h内静脉滴注完成；首日氟尿嘧啶400 mg/m2静脉推注，第2天及3 d氟尿嘧啶1 200 mg/m2静脉推注，每2周为1个疗程，共完成6个疗程化疗。化疗结束后每3个月以电话或门诊方式进行随访，统计患者5年生存情况。

1.5 统计学方法

运用SPSS 19.0软件分析，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表达情况

直肠癌组患者外周血中Galectin-3mRNA表达阳性率为63.0%（58/92），明显高于健康对照组10.8%（4/37）和直肠腺瘤组25.8%（8/31），差异具有统计学意义（P＜0.01）。直肠癌组患者外周血MUC1mRNA阳性率为53.3%（49/92），明显高于健康对照组5.4%（2/37）和直肠腺瘤组19.4%（6/31），差异具有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 3组患者外周血Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表达情况[n（%）]Table2 Expressions of Galectin-3 mRNA and MUC1 mRNA in 3 groups[n（%）]

2.2 Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA阳性率与直肠癌病理特征的关系

92例直肠癌患者中，Ⅰ+Ⅱ期患者Galectin-3mRNA和MUC1mRNA阳性率为51.4%和37.1%，Ⅲ+Ⅳ期阳性率为70.2%和63.2%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。高、中分化组Galectin-3mRNA和MUC1mRNA阳性率为55.2%和43.1%，低分化组为76.5%和70.6%，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。无淋巴结转移患者Galectin-3mRNA和MUC1mRNA阳性率为46.8%和36.2%，明显低于淋巴结转移患者80.0%和71.1%，差异均具有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3 Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA阳性率与直肠癌病理特征的关系Table3 The relationship between expression of Galectin-3 mRNA，MUC1 mRNA and rectal cancer pathological features

2.3 直肠癌患者生存分析

Kaplan-Meier曲线分析显示，Galectin-3mRNA和MUC1mRNA阳性患者5年生存率均明显低于阴性表达患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 直肠癌患者Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表达与5年生存期的关系Figure1 Relationship between Galectin-3 mRNA，MUC1 mRNA and 5-year survival in patients with rectal cancer

2.4 直肠癌患者血清Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表达的相关性

Spearman分析显示，直肠癌患者血清Galectin-3mRNA和MUC1mRNA的表达存在显著相关性（P＜0.05），见表4。

3 讨论

直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率较高，我国直肠癌发病率约占全球的1/3。以手术治疗为中心的综合疗法是直肠癌的主要治疗模式，不同分期的直肠癌患者所采取的治疗方案也不完全相同，因此，准确的临床诊断和分期对治疗方案的拟定至关重要[6]。目前直肠癌的临床诊断和分期主要以MRI（Magnetic Resonance Imaging）和肠镜超声为主，其操作较为复杂，而血清生物指标检测在直肠癌辅助诊断、病情评估方面也具有重要作用，逐渐成为目前医学研究的热门课题[7-8]。

表4 直肠癌患者血清Galectin-3 mRNA和MUC1 mRNA表达的相关性Table4 Correlation of serum Galectin-3 mRNA and MUC1 mRNA expression in patients with rectal cancer

Galectin-3为β半乳糖凝集素家族成员，存在于细胞质和细胞核内，通过与胞内糖蛋白、细胞表面因子及胞外基质蛋白的相互作用，减少肿瘤细胞的黏附，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，从而参与到肿瘤的发生、发展的全过程[9-10]。研究发现，Galectin-3可与T细胞表面CD29/CD7结合，诱导T细胞凋亡，阻止T细胞抗Fas抗体引起的凋亡，从而利于肿瘤细胞的免疫逃逸[11]。MUC1为Ⅰ型跨膜糖蛋白，能介导细胞间信号转导、调节机体免疫等，主要存在于多种组织器官的上皮细胞，呈顶端表达、极性分布。MUC1可与细胞核内Kruppel样因子4结合，抑制p53的转录功能，进而影响p53对损伤DNA的修复作用，导致了肿瘤的发生[12-13]。另有研究显示，MUC1能够激活肿瘤坏死因子等受体因子，抑制肿瘤细胞的凋亡[14]。目前国内外研究对Galectin-3、MUC1作为肿瘤特异性标志物已基本认可，但对两种因子与肿瘤患者预后关系的研究较少[15-16]。

本研究采用RT-PCR技术对外周血中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA进行检测，结果显示，直肠癌患者Galectin-3mRNA和MUC1mRNA表达阳性率均明显高于直肠腺瘤组和健康对照组，提示Galectin-3和MUC1的表达与直肠癌的发生有关。另外，研究发现Galectin-3和MUC1mRNA的表达与肿瘤的TNM分期、组织分化程度以及淋巴结转移有关，TNM分期越高以及淋巴结转移患者，Galectin-3mRNA和MUC1mRNA阳性发生率也越高，因此，对外周血中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA检测对直肠癌恶性程度评估具有一定参考价值。经5年后随访发现，Galectin-3mRNA和MUC1mRNA阳性患者5年生存率均明显低于阴性患者，提示Galectin-3mRNA和MUC1mRNA的表达与直肠癌患者预后存在相关性，两者可作为评估患者预后的参考指标。

有研究表明，细胞外Galectin-3可与细胞膜上MUC1结合，导致MUC1极化分布，暴露细胞表面多种黏附因子，促进肿瘤细胞的集聚，增强肿瘤细胞与血管内皮黏附性，从而在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用[17]。本研究发现，直肠癌患者外周血中Galectin-3mRNA和MUC1mRNA的表达呈显著正相关关系，说明Galectin-3mRNA和MUC1mRNA相互影响，共同参与直肠癌的进展过程。

综上所述，外周血Galectin-3mRNA、MUC1mRNA表达与直肠癌的发生、发展以及转移密切相关，Galectin-3mRNA、MUC1mRNA检测有助于对直肠癌患者预后评估提供参考。