肿瘤干细胞标记物CD133及LGR5在胃腺癌中的表达及意义

黎美仁，王丽丽，徐 晓

(1.九江学院附属医院病理科;2.九江市妇幼保健院急诊科，江西 九江 332000)

胃腺癌是目前世界范围内发病率及死亡率双高的恶性肿瘤，如何提高患者的生存期及生活质量是个长期值得关注的问题。现今，靶向治疗发展迅猛，CD133及LGR5作为胃癌干细胞潜在标记物，能否作为新的靶点让更多特别是晚期或不能耐受手术患者受益值得探讨。因此，本研究拟通过建立胃癌组织芯片，采用免疫组化技术检测胃癌中LGR5与CD133蛋白的表达情况，分析二者的表达及其与肿瘤临床病理参数之间的关系，有利于指导胃癌患者的治疗方案的选择和预后的评估，现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料收集2013～2015年九江学院临床医学院/附属医院病理科手术切除胃腺癌组织标本120例。标本类型包括：胃全切及胃部分切除标本。其中男86例，女34例；年龄33～81岁，中位年龄62岁，年龄>60岁者72例，年龄≤60岁者48例；肿瘤直径>5 cm者22例，肿瘤直径≤5 cm者98例，根据胃癌Lauren分型，弥漫型46例(图1)，肠型74例(图2)；按是否存在脉管瘤栓：44例存在，76例不存在；淋巴结转移情况，其中73例存在淋巴结转移，47例无淋巴结转移；临床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期41例，Ⅲ期44例，Ⅳ8例。取距离肿瘤大于5 cm处胃黏膜作为对照组织，每例标本的病理组织学诊断都经过两位有经验的高年资病理医师重新复片、审核。

1.2试剂浓缩型兔抗人CD133抗体、浓缩型兔抗人LGR5抗体(均为工作浓度1∶200，上海碧云天生物技术有限公司)； MaxVision试剂盒及DAB显色试剂均购自福州迈新生物公司。

图1弥漫型胃腺癌(HE×40)

图2肠型胃腺癌(HE×40)

1.3方法所有标本均经10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm切片，于二甲苯及梯度乙醇溶液中脱蜡水洗。免疫组化采用MaxVision法，应用PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性片作为阳性对照，按照试剂说明书进行操作。

1.4结果判定免疫组化结果由两位有经验的高年资病理医师采用双盲法独立阅片做出判断。结果判读，阳性定位于细胞膜，用半定量的方法对切片免疫组织化学法的染色强度进行评分：无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；再按阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞<5%为0 分，5%～25%为1分，26%～50%为2 分，51%～75%为3分，>76%为4分。最终评分=染色程度×阳性细胞所占百分比评分：0分为阴性，小于6分为弱阳性，大于等于6分为强阳性。

1.5统计学方法采用SPSS 19.9软件进行数据分析，CD133与LGR5在各组间样本率的比较采用卡方检验，CD133与LGR5在胃腺癌组织表达之间的相关性采用 Spearman 等级相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CD133和LGR5蛋白在胃腺癌及癌旁组织中的表达120例胃腺癌患者中，CD133蛋白阳性率36.7%(44/120)，其中强阳性29例(图3)，弱阳性15例(图4)，癌旁组织中CD133表达率5%，比较胃腺癌及癌旁组织中CD133的表达差异，P<0.05(χ2=36.480，P=0.000)，差异有统计学意义；LGR5 蛋白阳性率30.8%(37/120)，其中强阳性25例(图5)，弱阳性12例(图6)，癌旁组织中LGR5表达率2.5%，二者比较，差异有统计学意义(P<0.01)(χ2=34.680，P=0.000)。

图3胃腺癌中CD133蛋白强阳性表达(MaxVision×200)

图4胃腺癌中CD133蛋白弱阳性表达(MaxVision×200)

图5胃腺癌中LGR5蛋白强阳性表达(MaxVision×200)

图6胃腺癌中LGR5蛋白弱阳性表达(MaxVision×200)

2.2CD133和LGR5表达与胃腺癌临床病理参数间的关系比较120例胃腺癌患者CD133的表达，发现在不同性别、年龄及肿瘤大小之间的差异均无统计学意义(P>0.05)；而在不同Lauren分型(χ2=5.711，P=0.017)、有无脉管瘤栓(χ2=5.319，P=0.021)、有无淋巴结转移(χ2=7.880，P=0.005)及不同临床分期(χ2=9.198，P=0.002)时，P值均<0.05，差异有统计学意义。实验同时发现，LGR5在不同性别、年龄、肿瘤大小及Lauren分型之间的差异无统计学意义(P>0.05)；而比较有无脉管瘤栓(χ2=6.964，P=0.008)、有无淋巴结转移(χ2=4.358，P=0.037)及不同临床分期(χ2=3.925，P=0.048)时，发现P均<0.05，差异有统计学意义(见表1)。

2.3相关性分析在 120 例胃腺癌组织中，CD133及LGR5阳性者21例，二者同时阴性者60例，CD133阳性同时LGR5阴性者23例，CD133阴性同时LGR5阳性者16例，经Spearman等级相关性分析结果提示，胃腺癌中CD133与 LGR5 表达存在正相关(r=0.278,P=0.002)(见表2)。

3 讨 论

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，是严重威胁人民健康的疾病。在世界范围内，胃癌的发病率排第5位，死亡率排第3位[1]。胃腺癌占所有胃癌的95%，胃癌在发展中国家特别是亚洲国家有很高的发病率。随着社会经济的发展，卫生条件有了显著改善，但在中国，胃癌的发病人数及死亡人数仍然居高不下，据2015年统计数据显示，二者人数分别为67.9万例及49.8万例[2]。 67%～75%的患者开始接受抗肿瘤治疗时已处于进展期甚至终末期，预后很差。即使在西方国家，患者的5年生存率仍只有15%左右[3]。 早期发现仍然是提高胃癌生存率的最好办法。目前胃癌研究的主要问题是对胃癌肿瘤细胞的起源知之甚少，同时也缺乏可以作为治疗靶点的特异肿瘤标志。

近年来，发现大部分恶性肿瘤是受肿瘤干细胞(Cancer stem cell，CSC)驱动的。肿瘤干细胞假说认为肿瘤组织中存在极少量的具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的肿瘤干细胞，促使肿瘤的发生和发展。肿瘤干细胞在增殖过程中，通过不对称分裂,形成一个新的肿瘤干细胞和另一个最终分化为肿瘤细胞的子细胞，既产生肿瘤同时也维持了干细胞数目的稳定[4]。2006年美国癌症研究协会(AACR)对于肿瘤干细胞的定义是:具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。肿瘤干细胞具有无限增殖潜能，对肿瘤的发生、发展和转移起决定性作用，也是肿瘤复发、转移和治疗失败的根源。目前已从多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中成功分离和鉴定出肿瘤干细胞，其具有组织特异性标志物，如CD34、BMI-1、ABCG2等。

研究表明，Wnt通路的靶基因LGR5 (leucine-rich repeat containing g-protein coupled receptor 5)可能是胃肠道干细胞的标志。LGR5基因位12 q 15，大小为4 208 bp，含有907个氨基酸开放阅读框架(包括信号肽21个、胞外区540个、跨膜区263个和C末端尾巴83个)，其表达产物是一种7次跨膜蛋白，隶属于G蛋白耦联受体 (G-protein-coupled receptors, GPCRS)家族的成员。LGR5的配体为R-spondin,两者结合能够增强Wnt/β-catenin信号，并对干细胞生长起多效作用[5]。有学者报道LGR5阳性肿瘤细胞可以启动肿瘤的发生，而已分化的短期生存的LGR5阴性细胞不能启动肿瘤的发生[6]。Barker等研究认为，小鼠胃的LGR5阳性细胞分布具有年龄特性，新生小鼠LGR5表达在位于幽门的基底部及腺体集中区，而在成年小鼠，LGR5表达主要局限于成熟幽门腺体基底部，此部位是胃癌的好发部位之一[7]。LGR5现在被认为是胃癌的肿瘤干细胞标志物[8]，它还是食道腺癌、胰腺癌、大肠癌及乳腺癌的肿瘤干细胞标志[9-12]。Yamanoi 等[13]通过RT-PCR 发现癌组织LGR5 mRNA表达水平远高于非癌的黏膜组织，且与淋巴侵袭相关。Bu 等[14]在一组257例胃癌患者研究中，分析发现LGR5+患者的预后较LGR5-患者差，且LGR5 表达与肿瘤分型、淋巴结转移和TNM 分期相关。本组120例胃腺癌同多数研究结果一致，LGR5 蛋白阳性率30.8%，LGR5阳性胃癌患者临床分期较高，且更易出现脉管瘤栓及淋巴结转移。

CD133被认为是另一肿瘤干细胞的标志，CD133又称Prominin-1，其是含有5 个跨膜区域的单链糖蛋白，其N 端位于胞膜外，C 端位于胞膜内，并分别在胞膜外形成 2 个大环结构和在胞膜内形成2 个小环结构。Smith 等[15]的研究发现，在胃肠道肿瘤细胞上有CD133受体表达，通过CD133抗体与其结合后可使小鼠胃癌细胞系的生长延迟。陆瑞祺等[16]的研究证实，人胃癌细胞株中的CD133阳性(CD133+)细胞具有一定增殖分化及耐药潜能，这些均提示CD133+ 细胞可能是具有致瘤能力的肿瘤起始细胞。此外，其还被发现与直肠癌、非小细胞肺癌、脑胶质瘤和前列腺癌相关[17-20]。2010年，Ishigami 等[21]首次检测了97 例胃癌患者癌组织中CD133蛋白的表达情况，发现胃癌组织中CD133的阳性表达率达28%，该研究还发现，CD133与胃癌的浸润及淋巴结转移相关，从而认为其可能为判断胃癌预后的标志物。本研究发现胃腺癌中发现CD133与脉管瘤栓、淋巴结转移及临床分期呈正相关，同时发现CD133在不同Lauren分型中存在差异，其中弥漫型较肠型更易表达CD133(χ2=5.711，P=0.017)。Wen 等[22]对CD133表达与胃癌患者生存率的关系进行了系统评价，结果发现CD133+ 的胃癌患者5 年生存率较CD133-的胃癌患者低。

肿瘤干细胞标记物LGR5+及CD133+的胃腺癌，临床分期高，易于出现淋巴结转移及脉管瘤栓，这些因素都与预后密切相关，而二者表达与年龄、性别及肿瘤大小无明显关系。通过分析本组数据，发现胃腺癌中LGR5与CD133的表达成正相关，显示二者在胃腺癌的发生、发展过程可能存在协同作用，目前为止，研究二者间关系的报道不多，所以其二者间是以何种机制共同作用尚不明确，有待更多研究来发现。

综上，本研究结果显示，CD133与LGR5可作为胃腺癌干细胞潜在标记物，用于评估胃腺癌的恶性程度及作为新靶点研发相应靶向药物。