基于TG酶凝固的大豆蛋白凝胶生产工艺研究

孙 菁 ， 赵良忠 ，3，王 容 ，沈国祥

（1.邵阳学院食品与化学工程学院，湖南邵阳 422000；2.湖南省果蔬清洁加工工程技术研究中心，湖南邵阳 422000；3.豆制品加工技术湖南省应用基础研究基地，湖南邵阳 422000）

谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，简称TG酶）是一种催化酰基转移反应的转移酶，蛋白质和肽键中谷氨酞胺残基的γ-羧酰胺基为酞基供体[1-2]。不同来源的原料TG酶处理条件不一样，如鱼肉TG酶最适pH值7.5，最适温度30℃；豚鼠肉TG酶最适pH值6.0，最适温度50～65℃；微生物TG酶最适pH值6.0～7.0，最适温度50℃[3-6]。目前，TG酶在肉制品、乳制品和植物蛋白制品加工及环保型胶黏剂等多方面均有应用[7-8]。在豆制品生产中常以TG酶作为凝固剂。

蛋白质经过解离、变性，暴露出用于分子间交联的功能基团，在合适的条件下，相邻的蛋白分子通过化学作用力结合到一起形成三维网络结构，成为凝胶[9-10]。凝胶作用是蛋白质最重要的加工功能性质之一[11]，豆腐便是经过大豆蛋白凝胶加工而成[12]，加热、酸、盐和酶均可诱导形成大豆蛋白凝胶。大豆蛋白的主要蛋白组成是球蛋白，包括大豆豆球蛋白（glycinin） 和以主要7S球蛋白[13-16]形式存在β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）。大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量不仅是豆腐的品质指标[17]，还是反应大豆蛋白的凝固状态、决定最终豆腐的质构特性。试验以大豆蛋白凝胶保水性、水分含量和质构特性为指标，研究TG酶对大豆蛋白凝固特性的影响，探讨TG酶对大豆蛋白凝胶品质的影响，为TG酶在豆制品中的应用提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

大豆蛋白、TG酶，湖南君益福食品有限公司提供；氢氧化钠标定液、酚酞、乙醇溶液、戊烯二醛溶液、OsO4溶液，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

台式冷冻离心机，澳大利亚达卡米公司产品；LS型质构仪，美国阿美特克有限公司产品；MJ33型水分自动测定仪，梅特勒-托利多公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 凝胶制备

配制4%大豆蛋白溶液[18]，调节初始pH值，于95℃下水浴加热10 min，冷却至一定反应温度加入TG酶，控制反应时间。

1.3.2 单因素试验

（1）初始pH值条件试验。分别调节大豆蛋白溶液初始pH值至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，固定反应温度50℃，TG酶添加量0.2%，反应时间15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响

（2） 反应温度试验。调节大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，分别设置反应温度40，45，50，55，60℃，固定TG酶添加量0.2%，反应时间15 min，探究反应温度对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响。

（3）TG酶添加量试验。调节大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，设置反应温度50℃，使TG酶添加量分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，反应时间15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响。

（4） 反应时间试验。调节大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，设置反应温度50℃，固定TG酶添加量0.4%，控制反应时间分别为10，15，20，25，30 min，探究大豆蛋白反应时间对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响。

1.3.3 正交试验

以单因素试验结果为基础，选择初始pH值（A）、反应温度（B）、TG酶添加量（C） 和反应时间（D）4个因素进行四因素三水平正交优化试验，通过保水性和水分含量选出TG酶凝固条件最佳工艺组合。

1.3.4 凝胶腐保水性测定[19]

称取3 g（精确到0.000 1 g） 凝胶样品放置于底部垫有脱脂棉的离心管中，以转速1 200 r/min离心10 min，离心后称量上层凝胶的质量（W1），此后将此样品置于105℃下干燥至恒质量（W0）。持水率计算公式为：

1.3.5 凝胶水分含量测定

称取2 g样品放置于水分自动测定仪，测定完成后记录数据。

1.3.6 凝胶质构特性测定[20]

取凝胶中心部分切成长宽高分别1 cm正方体的样品，采用二次压缩方法测定质构。用P35圆柱形平底探头，测前、测中、测后速度分别40，30，40 mm/s，下压距离40%，停留时间5 s，触发力0.05 N。同一个样品选3个不同部分进行测试，取平均值。

1.4 数据分析

采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行相关性分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 初始pH值试验

初始pH值对凝胶保水性和水分含量的影响见图1，初始pH值对凝胶质构特性的影响见图2。

图1 初始pH值对凝胶保水性和水分含量的影响

图2 初始pH值对凝胶质构特性的影响

如图1所示，随着初始pH值的增大，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量均呈先上升后下降的趋势，在pH值5.0时有最大值，变化显著。大豆蛋白在等电点（pH值4.2～4.6）附近迅速聚集沉淀，蛋白质分子之间有序性降低[21]。蛋白质分子可能更容易与水分子结合，进而包裹更多水分子。在TG酶的作用下大豆蛋白质分子内或分子间交联作用加强，凝胶结构紧密，保水性提高，水分含量增大。TG酶的最适pH值为5～8时有较高活性，过于酸性的环境会使TG酶活性降低，从而降低TG酶与大豆蛋白分子之间的交联作用，不利于大豆蛋白分子与水分子的结合。由图2可知，硬度和咀嚼性随着初始pH值的增大呈先增大后减小的趋势，在初始pH值5.0时有最大值；弹性和内聚性变化趋势不规律，在初始pH值4.5时有最大值。初始pH值与质构指标硬度、咀嚼性和内聚性有显著性差异（p＜0.05），与弹性无显著性差异。

2.2 反应温度对凝胶品质的影响

反应温度对凝胶保水性和水分含量的影响见图3，反应温度对凝胶质构的影响见图4。

图3 反应温度对凝胶保水性和水分含量的影响

图4 反应温度对凝胶质构的影响

如图3所示，随着反应温度的升高，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量变化一致，均呈先上升后下降的趋势，在55℃时为最大值，变化显著。大豆蛋白预先在95℃下水浴加热10 min保证变性充分（蛋白质解热温度过高会发生热降解，从而使蛋白质失去凝胶能力），使蛋白质的巯基基团及疏水区域大部分暴露出来[22]，加入TG酶后更容易发生交联作用，大豆蛋白凝胶结构紧密，保水性好，水分含量高。TG酶的最适温度在45～55℃，温度过高TG酶活性下降，与蛋白质的交联作用减弱，形成的凝胶结构部松散、保水性低。由图4可知，硬度和咀嚼性随着反应温度的上升呈先增大后减小的趋势，在反应温度45℃时为最大值；弹性和内聚性变化趋势不规律，在反应温度50℃时为最大值。反应温度与质构指标硬度、咀嚼性、弹性有显著性差异（p＜0.05），与内聚性无显著性差异。

2.3 TG酶添加量对凝胶品质的影响

TG酶添加量对凝胶保水性和水分含量的影响见图5，TG酶添加量对凝胶质构的影响见图6。

图5 TG酶添加量对凝胶保水性和水分含量的影响

图6 TG酶添加量对凝胶质构的影响

如图5所示，随着TG酶添加量的增大，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量先缓慢上升，在0.4%有最大值，随后下降，变化显著。大豆蛋白稳定的空间结构由于TG酶发生交联作用变得不稳定，暴露出的大量疏水区域在疏水作用下进一步交联聚集，从而形成凝胶。但Sakamoto H等人[23]研究发现，随着TG酶添加量的增大，大豆蛋白质分子表面的作用位点可能很快被交联而降低了TG酶与蛋白分子交联的几率[24]，从而形成的蛋白质分子间凝胶结构少而松散。松散的结构使蛋白凝胶的保水性相对降低，水分含量减少。由图6可知，硬度和咀嚼性随着TG酶添加量的增大呈先增大后减小的趋势，在TG酶添加量0.4%时有最大值；弹性和内聚性变化趋势不规律，在TG酶添加量0.5%时弹性有最大值。TG酶添加量与质构指标硬度和咀嚼性有显著性差异（p＜0.05），与弹性和内聚性无显著性差异。

2.4 反应时间对凝胶品质的影响

反应时间对凝胶保水性和水分含量的影响见图7，反应时间对凝胶质构的影响见图8。

图8 反应时间对凝胶质构的影响

图7 反应时间对凝胶保水性和水分含量的影响

如图7所示，随着反应时间的增加，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量先上升后下降，在20 min有最大值，变化显著。充分的反应时间使TG酶催化蛋白质分子上酰基转移完全，交联作用加强凝胶结构趋于稳定紧密，保水性增大、水分含量增多。但Howell N K[25]的研究结果表明，凝固时间过长会使蛋白质分子上的巯基发生氧化，进而疏水作用减弱导致凝胶结构松散，保水性减小、水分含量减少。由图8可知，硬度和咀嚼性随着反应时间的增加呈先增大后减小的趋势，在反应时间20 min时为最大值；弹性和内聚性变化趋势不规律，在反应时间25 min时为最大值。反应时间与质构指标硬度和咀嚼性有显著性差异（p＜0.05），与弹性无显著性差异。

2.5 正交试验

正交试验设计与结果见表1。

采用极差分析法，对各因素均值及极差大小进行分析。由表1可知，TG酶凝固大豆蛋白的4个条件对凝胶的保水性和水分含量影响程度相同，主次顺序均为C＞A＞B＞D，即TG酶添加量＞初始pH值＞反应温度＞反应时间，即最优组合为A2B2C3D2，按此组合进行验证试验，结果表明，A2B2C3D2组合下凝胶保水性为78.21%，水分含量为84.35%，结构紧致，故A2B2C3D2组合为最优组合，即初始pH值5.0，反应温度55℃，TG酶添加量0.5%，反应时间20 min。

表1 正交试验设计与结果

2.6 凝胶品质相关性分析

采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行相关性分析。

凝胶品质相关性分析见表2。

根据表2进行凝胶品质相关性分析，保水性与水分含量呈极显著正相关（r为0.785），即保水性越大凝胶水分含量越高，这是因为水分与蛋白网络结构紧密结合不易流失；保水性与硬度和咀嚼性呈极显著正相关（r分别为0.639，0.581），即保水性越大凝胶的硬度和咀嚼性越大，这是因为蛋白网络空间结构包裹较多的水分导致硬度和咀嚼性增大。水分含量与硬度和咀嚼性呈极显著正相关（r分别为0.653，0.581），即水分含量越高硬度和咀嚼性越好，这是因为水分含量会直接影响凝胶强度，进而影响凝胶的硬度和咀嚼性。硬度与咀嚼性、弹性和内聚性呈极显著正相关（r分别为0.901，0.551，0.835），即硬度越大，咀嚼性、弹性和内聚性越好；咀嚼性与弹性和内聚性呈极显著正相关（r分别为0.659，0.653），即咀嚼性越大，弹性和内聚性越好；弹性与内聚性呈显著正相关（r为0.489），即弹性越大，内聚性越好。质构特性影响凝胶强度和蛋白质网络空间结构，进而质构特性间相互影响。

表2 凝胶品质相关性分析

2.7 凝胶品质主成分分析

采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行主成分分析。

凝胶品质主成分分析见表3。

表3 凝胶品质主成分分析

对凝胶品质进行主成分分析（principal components analysis，PCA），表3通过方差分解提取出2个主成分。第一主成分方差累积值能解释凝胶品质信息的64.639%，第二主成分方差累积值能解释凝胶品质信息的18.760%，一共反映了凝胶品质绝大部分信息83.399%。

主成分矩阵见表4。

表4 主成分矩阵

根据表4主成分矩阵分析，第一主成分与硬度和咀嚼性呈显著性相关（相关系数r分别为0.965和0.922），且第一主成分可解释凝胶品质信息的大部分，因此硬度和咀嚼性是决定凝胶品质的关键因素。

3 结论

传统豆清发酵液生产条件与TG酶作用大豆蛋白的条件范围有差异，试验确定了TG酶凝固大豆蛋白的最优条件为初始pH值5.0，反应温度55℃，TG酶添加量0.5%，反应时间20 min。通过对大豆蛋白凝胶品质进行相关性分析发现，除了硬度与弹性呈显著相关，硬度和咀嚼性均与其他指标均呈极显著相关；质构特性之间相关性十分复杂。通过主成分分析，确定硬度和咀嚼性是影响大豆蛋白凝胶品质的关键因素。