产乳酸芽孢杆菌制备高黄酮含量的砂仁发酵饮料

刘玉冰，梁钻好，黎 攀，夏 雨，吴俏槿，杜 冰

（1.广州丹吉儿生物科技有限公司，广东广州 510642；2.阳江职业技术学院，广东阳江 529566；3.华南农业大学食品学院，广东广州 510642；4.咀香园健康食品（中山）有限公司，广东中山 528437）

砂仁，姜科，豆蔻属多年生草本植物，与槟榔、益智仁、巴戟天并称“四大南药”。砂仁集中分布于我国福建、广东、广西和云南等地。中医和临床验证认为砂仁具有暖脾止泻、化湿开胃、镇痛、行气安胎、解酒醒神等功效[1-2]，其中主要的药理活性成分以挥发性油和黄酮类物质为主。砂仁富含黄酮类物质（不同产地的平均含量为0.25～0.90 mg/g）[3-4]，目前已从砂仁的水溶性成分中分离鉴定出槲皮苷、异槲皮苷和槲皮素[4-5]3种黄酮类物质。黄酮类物质具有很强的抗氧化和清除自由基的能力，不仅可以赋予饮料保健功效，还令饮料口感圆润。

植物次生代谢产物的微生物转化是近年来的研究热点[6]，而且有研究表明，微生物发酵可提高中草药的黄酮含量。如酵母菌[7]和黑曲霉[8]发酵黄芪可分别提高黄酮含量18%和129%；米曲霉和米根霉发酵紫米也可大幅提高（190.1%和122.5%） 总黄酮含量[9]；酿酒酵母发酵风柜斗草所获得的发酵液中总黄酮含量是水提液的2.6倍，其DPPH自由基和羟自由基清除能力均优于水提液的[10]。黄酮类物质转化的常规菌种为大肠杆菌[11-12]和酿酒酵母[13-14]，还可以考虑丝状真菌、乳酸菌、芽孢杆菌等其他微生物[15]。微生物的转化作用是复杂的，菌种、营养环境、原料特征等都会影响具有生物活性的次生代谢物的转化。如李宁等人[16]筛选的6株菌株中，只有1株具有高效转化藜蒿水提液总黄酮含量的能力，其他5株都会降低或不改变藜蒿水提液的黄酮含量。产乳酸芽孢杆菌DU-106（Bacillus sp.DU-106） 是经华南农业大学鉴定的一株新的芽孢杆菌属[17]，已应用于多种中草药[18-20]、谷物[21]、果蔬[22]的发酵中，其发酵饮料口感和风味均较佳。试验采用产乳酸芽孢杆菌DU-106发酵砂仁，探究发酵工艺对砂仁发酵饮料中总黄酮含量的影响，为砂仁黄酮的微生物转化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云南砂仁，购于当地药店；产乳酸芽孢杆菌DU-106（Bacillus sp.DU-106），筛选自传统发酵奶酪，由华南农业大学新资源食品与功能性原料评价及研究中心鉴定和保藏；橙皮苷标准品，HPLC＞98%；氯化钠、氢氧化钠、柠檬酸、二甘醇，均为分析纯。

FA2004A型分析天平，上海精天电子仪器厂产品；HH-4型数显恒温水浴锅，常州市华普达数学仪器有限公司产品；DHP-600型电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂产品；752-N型紫外分光光度计、PHs-3C型精密pH计，上海精密科学仪器有限公司产品；WYT型手持糖量计，泉州中友光学仪器有限公司产品；VD-650型桌上式洁净式工作台、DF-101S型高压灭菌锅，苏州净化设备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 菌种活化

0.1 g产乳酸芽孢杆菌DU-106菌粉溶于100 mL已灭菌并冷却至室温的生理盐水中，于30℃下活化30 min，得到菌种活化液。

1.2.3 单因素试验

称取去壳砂仁50 g，洗净后用100℃水热烫1～3 min，沥干水分，用纱布包好后加入300 mL煮沸放凉的水（内含30 g溶化的白砂糖），接种发酵（发酵期间用已消毒的小石头把砂仁压下去，确保砂仁不上浮在液面）。固定发酵温度26℃，发酵时间4 d，分别接种0.6%，1.8%，3.0%，4.2%，5.4%菌种活化液（以去壳砂仁的量计算），考查接种量对发酵饮料总黄酮含量的影响；固定接种量为3.0%，发酵温度26℃，分别发酵2，3，4，5，6 d，考查发酵时间对发酵饮料总黄酮含量的影响；固定接种量为3.0%，发酵时间4 d，分别在20，23，26，29，32℃下发酵，考查发酵温度对发酵饮料总黄酮含量的影响。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上进行L9（34）正交试验，以接种量、发酵温度和发酵时间为因素，每个因素各取3个水平。以总黄酮含量为指标，得出砂仁饮料发酵的最佳条件。

1.2.5 指标测定

总黄酮含量：参照NY/T 2010—2011柑橘类水果及制品中总黄酮含量的测定的方法测定发酵液中总黄酮含量；可溶性固形物含量采用手持糖量计测定；pH值采用pH计测定。

黄酮标准曲线见图1。

图1 黄酮标准曲线

1.2.6 感官评价

参照NY 82.2—1988果汁测定方法感官检验对砂仁发酵饮料进行感官评分。选取12名有经验的发酵饮料人员进行感官评价，得到的结果去掉最高值和最低值后取平均值。

砂仁发酵饮料评分细则见表1。

2 结果与分析

2.1 接种量对总黄酮含量的影响

表1 砂仁发酵饮料评分细则

接种量对砂仁饮料总黄酮含量的影响见图2。

图2 接种量对砂仁饮料总黄酮含量的影响

由图2可知，随着接种量的增加，发酵饮料中总黄酮含量不断增加，当接种量增加到4.2%时，饮料中总黄酮含量达到最高值，比0.6%的接种量高出34.4%。随后接种量继续增加，总黄酮含量略有下降。因此，以4.2%的接种量为宜。

研究表明，部分芽孢杆菌菌株可高效转化黄酮类物质[15-16]。产乳酸芽孢杆菌DU-106为芽孢杆菌属，兼性厌氧，一定的接种量可以加快消耗原料中的少量氧气[19]，促进繁殖和发酵的同时避免所转化的黄酮被氧化，确保黄酮保留高抗氧化活性。但是当接种量过大时，微生物繁殖过量，营养受限，发酵作用会受到抑制[19]，阻碍转化。

2.2 发酵时间对总黄酮含量的影响

发酵时间对砂仁饮料总黄酮含量的影响见图3。

图3 发酵时间对砂仁饮料总黄酮含量的影响

由图3可知，发酵时间较短时，饮料中总黄酮含量缓慢增加，发酵时间延长（3～4 d），总黄酮含量急剧增加，并在5 d达到最高值0.632 mg/g，随后发酵时间继续延长，总黄酮含量略有下降。

由于微生物菌株差异较大，其对黄酮的转化速率也存在较大的差异，高效转化时间从几小时到几天不等[16，23]。赵丹等人[9]采用米根霉发酵紫米，于27℃下发酵2.5 d获得最高黄酮含量（0.222 mg/g），郝红梅等人[7]采用酵母发酵黄芪，于28℃下发酵7 d获得最高黄酮含量（2.212 mg/g）。从总黄酮含量-发酵时间的变化曲线来看，试验采用的产乳酸芽孢杆菌DU-106在26℃下发酵砂仁，最适发酵时间为4～6 d。

2.3 发酵温度对总黄酮含量的影响

发酵温度对砂仁饮料总黄酮含量的影响见图4。

图4 发酵温度对砂仁饮料总黄酮含量的影响

发酵温度对饮料中总黄酮含量有显著影响。20～29℃时，饮料中总黄酮含量几乎随发酵温度的增加呈直线上升，温度每上升1℃，总黄酮含量增加0.040 mg/g。发酵温度为29℃时，总黄酮含量是发酵温度为20℃时的2倍以上。随后发酵温度继续上升，变化曲线趋于平缓。

产乳酸芽孢杆菌DU-106转化砂仁总黄酮含量的最佳温度为29～32℃，与李宁等人[16]筛选芽孢杆菌属菌株转化藜蒿水提液总黄酮含量的最佳温度（30℃）一致。一方面，这与产乳酸芽孢杆菌DU-106最适活化温度30℃有关，另一方面体现了微生物对植物次生代谢物的转化通常在温和条件下进行[6]，相比黄酮的常规高温热水（85～100℃） 浸提法或有机溶剂浸提法，微生物转化法具有反应条件温和、环境友好化、避免有机溶剂残留或污染等问题。再者，由于温和反应，相比常规的热水浸提法，微生物所转化的黄酮类物质可能获得更高的活性[10，23-24]。

2.4 正交优化试验

因素与水平设计见表2，L9（34）正交试验设计及结果分析见表3。

表2 因素与水平设计

由表3极差分析得知，采用产乳酸芽孢杆菌DU-106发酵砂仁，影响总黄酮含量的因素顺序为C＞A＞B，即发酵温度＞接种量＞发酵时间。

正交试验方差分析见表4，砂仁发酵饮料物化指标见表5。

表4方差分析显示，因素C的影响达到高度显著水平（p＜0.01），因素A和B的影响未达到显著水平（p＞0.05），与直观分析结果一致。

最佳工艺条件为A2B1C2，即接种量4.2%，发酵时间4 d，发酵温度29℃，在此条件下得到的总黄酮含量为0.725 mg/g。测得该条件下的砂仁发酵饮料的pH值为4.23，可溶性固形物含量为5.74%，感官评分16.9分，总体评价好。

表3 L9（34）正交试验设计及结果分析

表4 正交试验方差分析

表5 砂仁发酵饮料物化指标

3 结论

利用产乳酸芽孢杆菌DU-106转化砂仁总黄酮，在单因素试验的基础上进行正交优化试验，得到最佳工艺条件。影响总黄酮含量的因素顺序为发酵温度＞接种量＞发酵时间，接种量4.2%，发酵时间4 d，发酵温度29℃，此时砂仁发酵饮料可获得高达0.725 mg/g的总黄酮，对应的饮料pH值为4.23，可溶性固形物含量为5.74%，感官评分16.9分。微生物转化反应条件温和、转化率高，同时有望获得高活性的黄酮类物质，赋予中草药发酵饮料更佳的保健功效。