正交试验优化产地鲜制法半夏工艺研究

金盖宇，王海燕,李 娟,杨俊杰，熊之萍

中药半夏来源为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit的干燥块茎。具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效[1]。生半夏有毒，内服时需要炮制后才能入药。法半夏是《药典》规定品种，燥湿化痰力强，用于各类痰证。《药典》规定的法半夏炮制方法非常笼统，对甘草和石灰水的比例和用量没有明确要求，炮制时间也无详细规定。因此，各地炮制的法半夏质量参差不齐，疗效有很大差别。文献研究法半夏的主要指标性成分为半夏总生物碱和甘草酸[2]。本试验直接采用产地新鲜半夏为原料，加辅料炮制制备法半夏，采用正交试验设计法，以总酸(2015年版一部半夏含量测定项下指标)、总生物碱和甘草酸含量的综合作用为指标，对法半夏产地炮制方法进行研究，并以草酸钙针晶含量和家兔眼结膜刺激性试验评价法半夏的炮制减毒作用，以期为法半夏的产地加工提供技术指导。

1 材料、试剂和仪器

1.1 材料与试剂 新鲜半夏药材购于信阳市息县半夏种植基地，经信阳农林学院周巍教授鉴定为半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit的块茎；甘草(亳州市沪谯药业有限公司，批号1505502)；琥珀酸对照品(中国药品生物制品检验所，批号896-200001)；盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检验所，批号171241-200506)；甘草酸单铵盐对照品(中国药品生物制品检验所，批号110731-9202)；草酸基准试剂(购自河南省药品检验所)；纯化水自制；甲醇为色谱纯(天津四友)；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 L600-DP6高效液相色谱仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；ZD-3A型电位滴定仪(南京远拓)；梅特勒AB135-S电子分析天平(上海树信仪器仪表有限公司)；SCQ-8201E超声清洗仪(上海声彦超声波仪器设备有限公司)。

1.3 大耳白种家兔，雌雄不限，体重(1.5±0.2)kg,双眼正常，由信阳农林学院药理实验室提供。

2 方法与结果

2.1 总酸的含量测定 样品粉碎过四号筛，取粉末5g，精密称定，加95%乙醇50mL,加热回流1小时，过滤，再重复操作2次，合并滤液，蒸干。残渣加入0.1mol·L-1NaOH滴定液10mL溶解，超声处理(功率500w,频率40kHz)30 min，用蒸馏水定容至50mL。精密量取25mL，照电位滴定法(附录ⅧA)测定，用盐酸滴定液(0.1mol·L-1)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。根据有机酸消耗NaOH滴定液(0.1mol·L-1)的体积，计算有机酸含量。每1mL氢氧化钠滴定液(0.1mol·L-1)相当于5.904mg的琥珀酸(C4H6O8)[3]。

2.2 总生物碱的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸麻黄碱对照品适量，用氯仿溶解，制得浓度为0.0632mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10、12mL置于分液漏斗中，分别加蒸馏水10mL，pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液10mL，氯仿10mL，0.1%溴麝香草酚蓝溶液1mL，充分振荡，放置30min，取氯仿层作为供试样品。另取1mL水用同样方法制备空白对照液。在417nm波长测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，求得回归方程为A=0.1548C+0.0057，r=0.9996(n=6)，表明盐酸麻黄碱在9.72～32.97μg·mL-1呈良好的线性关系。

2.2.3 供试品溶液的测定 取法半夏粉末5g,精密称定，置于50mL三角瓶中，加入12%氨水适量，将样品搅拌至湿润，加入氯仿100mL，浸泡12h，超声提取40min，过滤，残渣以10mL氯仿分3次洗涤，合并滤液与洗液，用氯仿稀释至刻度，摇匀，取提取液10mL，浓缩至干，加入pH6.0缓冲液5mL，氯仿10mL，0.1%溴麝香草酚蓝溶液1mL，充分振荡，移至50mL分液漏斗，静置30min，分取氯仿层，在417nm波长测定吸光度，计算，即得[4]。

2.3 甘草酸含量测定

2.3.1 色谱条件 PM952505-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙酸铵(0.2mol·L-1)-冰醋酸(67∶33:1)为流动相；检测波长为250nm。

2.3.2 对品溶液的制备 精密称取甘草酸单铵盐对照品适量，用流动相配制成0.3mg·mL-1的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 称取法半夏1g，精密称定，置25mL锥形瓶中，加流动相8mL，超声处理1h，放冷，置于10mL容量瓶，用流动相定容。

2.3.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液5～10μL，注入液相色谱仪，测定，即得[5]。

2.4 炮制工艺的正交试验设计

2.4.1 因素-水平表 以总酸、总生物碱和甘草酸含量为指标，以L9(34) 正交表进行设计，对甘草：石灰、炮制温度、炮制时间和浸液pH进行考察。因素-水平见表1。

表1 因素-水平表

2.4.2 正交试验结果 取半夏鲜药材200 g，按正交表中炮制方法制得法半夏，测定总酸、总生物碱和甘草酸含量。正交试验设计结果如表2所示。

表2 正交试验设计结果

综合分=(X/Xmax)×35%+(Y/Ymax)×35% +(Z/Zmax)×40% X:总酸含量 Y：总生物碱含量 Z：甘草酸含量

对正交设计试验结果进行直观分析，可知各因素影响的主次顺序为：甘草：石灰>炮制时间>浸液pH>炮制温度。在考察范围内，炮制工艺的最佳条件可选择为：A3B2C1D1。

表3为方差分析结果，由F值可知甘草、石灰用量比有显著性影响。结合实际，确定炮制方法为：甘草：石灰比例15:10，炮制时间为2d，pH值为12，炮制温度为30℃。

表3 方差分析表

2.5 法半夏毒性试验

2.5.1 对照药材制备 取同批鲜半夏，置烘箱50℃干燥，干燥品即为生半夏。取生半夏按照药典规定方法进行加工，干燥，得到药典法半夏品。

2.5.2 草酸钙针晶含量测定 色谱条件：ODS-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱；流动相0.5%KH2PO4-0.5mmol/L TBA水溶液(pH=2.0),以磷酸调节pH值，检测波长254nm。

对照品溶液制备 精密称取草酸对照品适量，用蒸馏水配制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液，即得。

供试品溶液制备 分别精密称取生半夏、优选法半夏和药典法半夏粉末(60目)各0.1g，置玻璃容器中，加入3mL蒸馏水混匀，振荡5min，置60℃水浴加热并搅拌10min，3000r·min-1，离心5min,残渣以热纯水洗涤2次，每次2mL，混匀离心，取药材残渣，加0.2mL HCl(1:1)溶液，3.0mL纯水混匀，置70℃水浴，边搅拌边加热10min，离心(条件同上)，分离沉淀于上清液，沉淀用0.1mol·L-1HCl，同上法处理2次，每次2mL，离心，合并上清液，置10mL量瓶，纯水定容至刻度，即得。

测定分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液5～10μL，注入液相色谱仪，测定，即得[6]。

将所得数据用SPSS23.0软件进行处理，进行单因素方差分析。结果如表4所示。

表4 草酸钙针晶含量试验结果

由表4可知，优选法半夏和药典法半夏都能显著降低刺激性成分草酸钙针晶的含量，而优选法半夏和药典法半夏之间的草酸钙针晶含量差别不明显。

2.5.3 家兔眼结膜刺激性试验 取家兔随机分组，将20%生半夏混悬液、20%优选法半夏混悬液、20%药典法半夏混悬液分别滴入兔左右眼中，每组样品用兔眼6只，每只眼给药两滴。给药后，闭合眼睑5～10s，2min后立即用40～50mL生理盐水冲洗眼睛至眼中无任何异物，随后1.5～3h内观察兔眼情况，根据刺激情况打分[6]。将所得数据用SPSS23.0软件进行处理，进行单因素方差分析。结果如表5。

表5 家兔眼结膜刺激性试验(n=6)

由表5可以看出，优化法半夏和药典法半夏与生半夏比较均可以显著降低半夏的刺激性，二者差别不大。

3 讨 论

关于法半夏加工方法的研究，到目前为止尚未见到产地鲜制法半夏的报道，本研究填补这方面的空白。本试验以正交试验表设计产地鲜制法半夏的炮制工艺，对加工过程中生石灰、甘草用量比、炮制温度、炮制时间和浸液pH值进行考察，并采用综合评分和方差分析进行工艺优选。得到产地鲜制法半夏的炮制工艺为：室温，每100g鲜半夏，用甘草15g,生石灰10g，浸泡2d，保持浸液pH12以上。较药典法显著缩短了加工时间，提高了生产效率，并量化了各工艺参数，为法半夏的产地加工提供技术指导。但干燥方法或干燥温度是否影响法半夏中有效部位含量和法半夏质量，还有待进一步研究。本试验还评价了优化法半夏的炮制减毒作用，结果表明用本试验确定的优化法半夏较生半夏，草酸钙针晶含量显著降低，家兔眼结膜刺激性试验中刺激程度也显著减小；与药典法半夏比较，草酸钙针晶含量和家兔眼结膜刺激性一致，同样达到了减毒的目的。

本研究确定的法半夏加工方法操作简单，对加工设备、技术要求低，易于普及，且法半夏饮片质量重现性良好，可为有关部门制定法半夏饮片炮制品标准提供参考。