响应面法优化超声辅助离子液体提取黑豆花青素工艺研究

苏适，于德涵，柴宝丽，迟彩霞

(绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061)

黑豆为豆科植物大豆的干燥种子，味甘性平，含有不饱和脂肪酸、蛋白质、碳水化合物、纤维素、花青素、硒、磷、铁多种微量元素和营养成分[1]。此外，黑豆还含有多种具有生理功效的物质，如黑豆红色素、多糖和皂苷等。其中花青素是黑豆色素的重要成分，具有较强的抗氧化能力，对机体代谢过程中产生多余的自由基，对增加血管弹性、延缓机体衰老等都有一定的作用[2,3]。黑豆比黄豆有更高的医药价值和开发前景，花青素属于类黄酮类的化合物，黑豆皮色素含量高，是一种天然、安全、健康的食用色素。

目前，采用浸提法提取花青素的应用较多，但此法溶剂用量大、耗时长、花青素得率较低[4]。超声提取法在中草药提取中应用较多，利用超声波的空化效应和机械效应，破坏植物组织细胞[5]，加强成分的溶出和扩散，将植物中的化学成分快速提取，提高产物的提取率，具有操作简单方便、耗时短、不破坏有效成分、提取液杂质少等特点。离子液体(ionic liquid)是在室温下完全由离子组成的液体物质[6]。离子液体能够吸收超声波，可用于超声辅助提取的天然产物的溶剂，具有理化性质稳定、不易燃烧、使用中挥发性低、提取过程萃取能力好、可重复利用等特殊性质[7-9]，同时可以通过超声或升高温度等方法提高有效成分的提取率，保持其高溶解性和萃取能力[10]。采用离子液体-超声辅助提取黑豆中花青素的研究尚未见报道。因此，本文运用此方法，以黑豆皮为原材料提取花青素，资源广泛，通过响应面法得出最佳的提取工艺，同时研究黑豆皮花青素的抗氧化活性，为深入研究其应用价值提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青仁黑豆，产地为黑龙江省。

原花青素标准品：中国药品生物制品检定所；1-己基-3-甲基咪唑溴盐(纯度99%)：阿尔法试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

VGT-2013QT超声波清洗器 广州固特超声仪器有限公司；XV-9200紫外分光光度计 北京市精密仪器厂；高速万能粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线

显色剂组成A∶B为1∶1。

A为甲醇溶液将1.0000 g 香草醛定容于100 mL容量瓶中；B为甲醇溶液将8.00 mL 浓盐酸定容于100 mL容量瓶中。

采用香草醛-盐酸法测定黑豆皮原花青素的浓度。精密称取10 mg原花青素标准品，用蒸馏水配制成0.1 mg/mL的标准品溶液。分别精确量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mL标准品溶液于10 mL 容量瓶中，加入5.00 mL显色剂，用1%的盐酸甲醇溶液稀释至刻度线，摇匀，在 30 ℃恒温水浴中恒温 30 min，在530 nm波长处测定吸光度，以甲醇作为空白，以原花青素浓度(mg/mL)为X 轴，吸光度为 Y 轴，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.9710X+0.0058，R2=0.9975。

1.3.2 黑豆皮花青素的提取

黑豆皮干燥到恒重，粉碎→ 过60目筛→ 准确称取1.0 g→加入离子液体乙醇溶液→超声提取→离心30 min→测定上清液中花青素含量。

1.3.3 提取率计算

移取1.0 mL提取液，置于25 mL 容量瓶中，稀释至刻度，在530 nm 处测定吸光度，依据标准曲线计算提取液中花青素浓度。

式中：C为花青素浓度(μg/mL)；V为定容体积(mL)；n为稀释倍数；M为黑豆皮质量(g) 。

1.4 提取工艺优化

准确称取黑豆皮1.0 g，采用离子液体-超声辅助法提取黑豆花青素，考察离子液体浓度(0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mol/L)、超声时间(15，25，35，45，55，65 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、提取温度(20，30，40，50，60，70 ℃)对黑豆花青素提取率的影响，在单因素试验基础上设计了四因素三水平试验。

1.5 响应面试验设计

根据单因素试验，选取离子液体浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取温度(D)，以黑豆花青素收率为响应值，根据Box-Behnken Design中心组合设计原理，优化黑豆花青素提取工艺，以花青素的提取率为响应值，建立响应回归模型，因素水平见表1。

表 1 响应面试验设计Table 1 Design of response surface experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 离子液体浓度对提取率的影响

图1 离子液体浓度对提取率的影响Fig.1 Effect of the concentration of ionic liquid on extraction yield

由图1可知，随离子液体[Bmim]Br 浓度的增加，花青素的提取率逐渐变大，当[Bmim]Br 浓度为0.8 mol/L 时，花青素提取率达到最大值，但随着离子液体浓度继续增大，提取率逐渐下降。原因可能与提取溶剂的黏度相关，离子液体的浓度过高，提取液黏度也会增大，提取剂的扩散能力变差，难以渗到黑豆细胞的内部，使得[Bmim]Br对黑豆花青素的溶出能力降低。因此，选择离子液体[Bmim]Br 浓度为0.8 mol/L。

2.1.2 提取时间对提取率的影响

图2 提取时间提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield

由图2可知，随提取时间的不断增长，花青素提取率呈现增长趋势，提取时间为45 min时，提取率达到最大值，但时间超过45 min，提取率开始降低。随着提取时间继续延长，通过超声波空化作用和机械震动的持续作用，黑豆皮花青素向溶剂中逐渐溶出，提取率逐渐升高；但是提取时间过长导致细胞组织中大量细胞破裂，增加了其他杂质的溶出；同时，提取时间过长会破坏花青素的结构，从而使提取率下降。因此，提取时间选择45 min。

2.1.3 料液比对提取率的影响

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction yield

由图3可知，随着料液比的增长，花青素提取率逐渐增大，料液比为1∶50(g/mL)时，花青素提取率达到最大值，但料液比超过1∶50(g/mL)，花青素的提取率开始下降。原因可能是黑豆皮的质量一定，提取剂的料液比过小，离子液体有一定的黏度，不利于花青素在溶剂中扩散，花青素向提取液转移不完全；随着料液比的增大，黑豆皮粉末在溶液中的分散程度增大，与提取液的接触面积增大，有利于花青素的溶出；但大量溶剂会吸收一定的超声波，降低了超声波对细胞的破碎能力，导致细胞内花青素溶出减少，提取率下降；还可能因为乙醇和[Bmim]Br与花青素分子上的羟基之间存在氢键作用，随着料液比的不断增大，氢键作用逐渐增强，导致花青素的提取率降低。因此，料液比选择1∶50(g/mL)。

2.1.4 提取温度对提取率的影响

图4 提取温度对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield

由图4可知，随着提取温度的升高，花青素提取率逐渐增大，当提取温度为50 ℃时，提取率最大，但温度继续升高，提取率出现不断降低的趋势。原因可能是随着体系的温度升高，离子液体的运动速率和频率也不断变大，使其更容易渗透到黑豆皮组织细胞中，加速花青素的溶出，从而增加花青素的提取率。但继续升高体系的温度，过高的温度会使花青素结构上的酚羟基发生氧化，导致其结构被破坏；也可能因为随着温度升高，细胞中其他内容物溶出增多，导致溶液黏度增大，影响花青素向外溶出，从而使提取率下降。所以，选择提取温度50 ℃。

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面设计及结果

表2 响应面试验设计方案Table 2 Design scheme of response surface test

续 表

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行分析，得到二次回归拟合方程Y=4.21+0.084A+0.039B+0.080C-0.017D-0.025AB+2.750E-003AC-0.027AD-0.020BC+0.023BD-0.020CD-0.37A2-0.17B2-0.10C2-0.20D2。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

续 表

注：P>0.05为不显著；P<0.05为显著；P<0.01为极显著。

对回归方程进行显著性检验，由表3可知，P<0.0001，说明数据模型方程达到极显著水平；失拟值P=0.9972>0.05，无显著差异，说明回归方程与试验拟合良好，误差小。回归方程各项方差分析表明，回归模型一次项 A，B，C为模型极显著因素，二次项 A2、B2、C2、D2为模型极显著因素，其余各项对黑豆皮花青素得率影响均不显著。因此，可用此模型对黑豆皮花青素提取工艺和提取率条件进行分析及预测。

2.2.2 响应面分析

响应曲面图可以显著反映各因素之间相互作用的强弱，采用Box-Behnken 软件对响应曲面图进行分析，可以得到各因素交互作用对响应值的影响，结果见图5。如果响应曲面较陡峭，说明该因素对花青素得率的影响较大，响应值对于提取条件的改变就越敏感；如果响应曲面相对平缓，说明该因素的波动对响应值的影响较小。

图5 各因素交互作用的响应面图Fig.5 Response surface figures of the interaction of various factors

由图5可知，离子液体浓度与提取温度之间交互作用的响应曲面最陡峭，对响应值影响最显著；离子液体浓度与提取时间之间交互作用的响应曲面相对陡峭，说明对响应值影响显著程度次之；提取时间与提取温度、提取时间与料液比、料液比与提取温度、离子液体浓度与料液比的交互作用对提取率的影响显著程度逐渐减小，表现为曲线较为平滑，响应值无显著性变化。可知影响黑豆皮花青素提取率的各交互作用因素顺序为AD>AB>BD>BC>CD>AC。

2.2.3 验证试验

结合单因素试验，分析回归模型，经过验证，最终得出该提取方法准确可靠、可行。黑豆皮花青素的最佳提取条件：离子液体浓度0.93 mol/L，提取时间45.39 min，料液比1∶50.96，提取温度43.94 ℃，理论预测值4.1291 mg/g。结合实验实际情况，最终选择离子液体浓度0.9 mol/L，提取时间45 min，料液比1∶51，提取温度44 ℃，进行5次平行试验，得到花青素提取率平均值为4.118 mg/g，与预测值接近，验证了此模型的有效性，说明预测模型与实际情况拟合较好。

2.3 与传统提取法的比较试验

为了对比传统提取方法和离子液体对黑豆皮的提取效果差异，分别采用乙醇加热回流法、乙醇超声辅助提取法和[Bmim]Br的离子液体超声辅助提取法在优化的条件下对花青素进行超声波辅助提取。由表4可知，离子液体超声辅助法提取黑豆花青素的提取率均高于普通溶剂。离子液体对天然成分提取的优势是由于有机阴离子对植物纤维素有极强的溶解性，能极大破坏植物细胞壁，并通过氢键、色散力、范德华力等方式结合活性成分，使天然成分更容易溶出。在超声波辅助作用下，超声的空化效应能加速离子液体穿透植物组织，促进植物组织内的黑豆花青素溶出，同时[Bmim]Br可能作为一种载体将黑豆花青素从植物细胞内转运出来，从而提高了黑豆花青素得率。

表4 离子液体与传统溶剂的比较Table 4 Comparison of ionic liquid with traditional solvent

3 离子液体的回收

由于[Bmim]Br离子液体的密度大，沸点高，提取后的离子液体中加入与其不互溶的乙酸乙酯来分离花青素，分离出与乙酸乙酯不互溶的离子液体，再减压蒸馏蒸除水分，再在真空烘干箱中65 ℃烘干，对分离出的离子液体进行吸光度测定，回收的离子液体吸光度值与未使用过的离子液体吸光度值接近。采用回收的[Bmim]Br离子液体进行重复提取，进行 3 次平行试验，提取率达到首次提取率的92.55%，因此，可再重复利用进行提取。

4 结论

本研究采用离子液体-超声辅助提取法，对黑豆皮花青素的提取工艺进行了研究。根据响应面法优化提取工艺，得到最佳工艺条件为：离子液体浓度0.9 mol/L、料液比 1∶51(g/mL)、提取温度44 ℃、超声时间 45 min，进行5次平行试验；在此条件下黑豆皮花青素的提取率可达4.118 mg/g。离子液体的极性可控，可以对中药中的复杂成分进行选择性提取，与传统提取工艺相比，该提取工艺时间短，所需溶剂少，离子液体可重复利用。本文采用离子液体超声辅助提取黑豆皮中花青素，获得较优提取工艺参数，可为深层次开发天然色素的研究提供理论依据，有益于黑豆皮花青素在食品工业上的推广与应用。